蜂毒肽抗肿瘤机制及临床应用进展

李迎涛，姜宝华，闫路娜，邱 丹，王 莉

（1.河北科技大学 生物科学与工程学院，河北 石家庄 050018；2.河北政法职业学院 公共基础部，河北 石家庄 050061）

蜂毒肽抗肿瘤机制及临床应用进展

李迎涛1，姜宝华2，闫路娜1，邱 丹1，王 莉1

（1.河北科技大学 生物科学与工程学院，河北 石家庄 050018；2.河北政法职业学院 公共基础部，河北 石家庄 050061）

蜂毒肽（Melittin，MLT）是蜂毒的主要成分，在蜂毒中含量最高，大约为蜂毒干重的50%，是蜂毒生物活性的主要载体。蜂毒肽作为一种重要的抗菌肽具有抗菌消炎、镇痛、抗辐射、抑制血小板凝集、抗艾滋病病毒等多种药理学作用。目前，蜂毒肽已成为抗肿瘤新药中的研究热点。本文综述了最新的蜂毒肽抗肿瘤机制及其应用，若将各种蜂毒制剂联合化疗，具有减毒增效的作用，在临床上具有很好的疗效，其潜在的药用价值日益引起人们的重视。

肿瘤；蜂毒肽；凋亡；调控机制

蜂毒是一种成分复杂的混合物，主要含蛋白质、肽类、生物胺和其他小分子有机物。蛋白质类主要有透明质酸酶（hyaluronidase）和磷脂酶A2（phospholipase，PLA2）；肽类主要有蜂毒溶血肽（又称蜂毒肽，melittin）、蜂毒明肽（apamin）和肥大细胞脱粒肽（mast cell degranulating peptide，MCD肽）；生物胺主要有组胺、多巴胺、去甲肾上腺素和氨基丁酸；小分子有机物主要有糖类、磷脂类、氨基酸类、胆碱、甘油和挥发性化合物（一种信息素）。蜂毒溶血肽（Melittin，MLT）占蜂毒的40%以上，是蜂毒发挥药理作用和生物活性的主要成分。其作为一种重要的抗菌肽具有抗菌消炎、镇痛、抗辐射、抑制血小板凝集、抗艾滋病病毒等多种药理学作用。国外类似的制剂有英国BVV药厂的Melittin，苏联的Aplite。这些制剂已除去了蜂毒中引起过敏的高分子量组份——透明质酸酶及磷醋酶A2。蜂毒肽具有很强的表面活性，直接破坏细菌的细胞膜，造成细胞的裂解致死。所以理论上讲蜂毒肽具有广谱性和速效性杀菌的优良特性。与抗生素相比，蜂毒抗菌肽具有抗菌谱广、低浓度下也可发挥作用、不易使微生物产生耐药性以及可以合成不同于天然肽的类似物等优势。

一、蜂毒肽的分子基础及构效关系

蜂毒肽是由26个氨基酸组成的两亲性α-螺旋结构，是一种线性肽，有四个二硫键连接，其相对分子量为2849（前体分子量7Kd），氨基酸的排列顺序为：甘-异亮-甘-丙-缬-亮-赖-缬-亮-苏-苏-甘-亮-脯-丙-亮-异亮-丝-色-异亮-赖-精-赖-精-谷-谷。蜂毒肽的N末端起前20个氨基酸残基主要是疏水的，而C末端的6个氨基酸残基主要是亲水的。在通常情况下，C-末端有4个氨基酸残基携带正电荷，N-末端有2个氨基酸残基携带正电荷，整个分子带6个正电荷。分子中三个赖氨酸和二个精氨酸残基的存在使蜂毒溶血肽成为强碱性肽，在中性水溶液中，其作为单体是以随机的卷曲结构存在的。蜂毒肽可以自我交联，形成a螺旋的四聚体结构。蜂毒肽的两亲性是膜结合肽和膜蛋白跨膜螺旋的特征，所以这个特性决定它既可以溶于水，又可以与膜自然结合，进而溶解细胞。蜂毒肽是种低分子量组份，其分子N端的疏水基团与细胞膜磷脂的结合、溶解了细胞膜，起到了细胞毒素作用。有学者研究证实，蜂毒肽在高浓度时，形成四聚体状态，能够比单体更有效的与细胞膜结合，形成了离子通道从而改变了细胞膜的通透性，引起Ca2+内流，通过升高胞内Ca2+浓度使细胞裂解，达到杀伤肿瘤细胞的目的。蜂毒肽的分子小，比起蓖麻毒素或喉毒蛋白等分子量较大的毒素，免疫原性低且不易产生过敏反应。对正常胞的毒性较低所以可较大剂量使用。蜂毒肽是迄今为止人类所知抗炎活性最强的物质之一，它能够抗菌抗病毒，可以抑制20多种革兰氏阴性和阳性细菌的生长繁殖。除此之外，蜂毒肽还具有良好的抗肿瘤作用。它可以与其他抗菌肽组成杂交肽分子，使抗肿瘤作用明显加强。探讨蜂毒肽抑制肿瘤细胞的作用机理，对肿瘤的临床治疗具有重要的理论和应用价值。

二、蜂毒肽抗肿瘤作用的机制

1.直接将肿瘤细胞杀伤。①在细胞上直接形成孔隙溶解细胞。蜂毒肽等裂解肽，可以在细胞膜上形成孔隙，其机制与结合到膜表面和插入膜的结合肽的阀值水平有关。分析表明，蜂毒肽在两性脂膜上不仅形成孔隙，也抑制孔隙的形成，这是两个模式竞争反应的结果：直接插入到膜里面和平行结合到膜表面。蜂毒肽可以在毫秒之内结合到脂膜上，采用α-螺旋结构，垂直或平行结合到膜平面。蜂毒肽的直接插入会导致孔隙的形成，然而平行结合的蜂毒肽却无效，并且平行结合的蜂毒肽还会阻止其他蜂毒肽的插入，从而防止形成孔隙。这些观察结果引出了孔隙形成两步模式的观点：低浓度的蜂毒肽平行结合到膜上，浓度升高时转变为垂直构像，导致孔隙的形成。目前对从平行到垂直构象的转变还缺乏了解，主要因为阳离子蜂毒肽（pH=5）与脂质的作用强烈（磷脂酰胆碱的分配系数为104～105mol/L），并且从平行转换到垂直时所需能量时非常大。基于蜂毒肽对磷脂酰胆碱基团的高强亲和力，人们普遍认为形成孔隙所需要的蜂毒肽浓度不是蜂毒肽的绝对浓度，而是相对浓度。然而，还没有直接通过改脂质的浓度和确定结合程度或自由蜂毒肽片段的方法测验过。蜂毒肽潜在药用价值引起了科学家的很大兴趣，在所有裂解肽中，26个氨基酸残基的蜂毒肽是目前研究最好的。②激活肿瘤细胞上的磷脂酶从而使细胞死亡。蜂毒肽可以根据膜浓度的比例，抑制或激活磷脂酶的活性。低浓度的蜂毒肽抑制PLA2，当浓度≥1μmol/L时，则激活PLA2。通过在人血清中蜂毒肽降解大肠杆菌释放脂肪酸的实验发现，血清中存在一种对热和胰岛素敏感的因子，这种因子对蜂毒肽激活磷脂酶的过程有促进作用，同时也可激活磷脂酶D。蜂毒肽与肿瘤细胞作用后，降解掉肿瘤细胞膜上的Band-2蛋白的一个亚型。Band-3蛋白被降解为两部分。Band-3蛋白是构成肿瘤细胞膜跨膜蛋白的主要组成部分，Band-3蛋白不但构成细胞膜上的离子通道，还具有抗菌抗病毒以及防止蛋白水解酶水解膜蛋白的作用。Band-3蛋白水解后，离子无法进出细胞膜从而导致细胞代谢功能的失调，细胞的正常生命活动受阻，从而导致细胞的死亡。由于膜保护剂被破坏，肽分子间接激活了膜上或环境中的蛋白酶，并与Band-2结合，使磷酸化作用和Ca2+-ATP酶活性受到抑制，且影响Band-2蛋白的膜收缩作用和膜骨架功能，从而导致整个膜的功能失常。

2.诱导细胞启动凋亡程序。许多化学药物可以通过诱导肿瘤细胞启动凋亡程序使细胞自动凋亡，从而达到抗肿瘤的目的。能否诱导细胞启动凋亡程序是筛选抗癌药物的一个标准。有实验显示，蜂毒肽在体外能够抑制人胃癌细胞株SCG-7901，可以将胃癌细胞阻滞在G2/M期，同时诱导癌细胞启动凋亡程序。有人通过建立人肝癌裸鼠移植瘤模型进一步探讨蜂毒肽的体外抗肿瘤作用。认为，蜂毒肽对提高移植瘤的抑制率具有显著作用，移植瘤的体积与药用时间的长短，有要的剂量的多少呈正相关。细胞凋亡是调节肿瘤生长的一个重要因素，肿瘤之所以产生，是细胞分化、增殖、凋亡异常的结果。蜂毒肽对肝脏肿瘤细胞Hep-2裸鼠皮下移植瘤的生长具有强烈的抑制作用，可以极大的增强机体的免疫功能，因此诱导肿瘤细胞启动凋亡程序可能是蜂毒肽抗肿瘤的机制之一。蜂毒肽能够激活磷脂酶A2，激活的磷脂酶A2能够使线粒体膜和溶酶体膜丧失稳定性，从而导致线粒体和溶酶体破裂继而将细胞杀死。蜂毒肽还可以将线粒体膜内的结合蛋白质释放出来，这一步在早期引起细胞凋亡的众多途径中是关键一步。蜂毒肽还可以强烈抑制钠钾泵的功能，使细胞丧失正常的膜电位，导致细胞膜功能失常。AFP促进肿瘤细胞增殖的重要的内源性物质之一，然而它却抑制免疫细胞的DNA合成和细胞的分裂。有实验证明，AFP与蜂毒肽起拮抗作用，起到促进肿瘤细胞生长，抑制肿瘤细胞凋亡的作用。种种研究结果表明AFP基因的异常表达是维持肝癌细胞恶性生长的分子基础，利用AFP转录调控序列驱动治疗基因表达是肝癌靶向基因治疗的主要方法之一。

3.影响肿瘤细胞的生物学行为。肿瘤细胞与宿主细胞、细胞外基质经过一系列多步骤、复杂的相互作用就可能形成恶性肿瘤的侵袭。肿瘤细胞的转移也与粘附分子有关。在肿瘤细胞转移的整个过程都伴有细胞的脱落与聚合、粘附与去粘附。有研究显示蜂毒肽基因转染可以抑制CD54分子的表达，通过改变肿瘤的生物学行为达到抗肿瘤的效果。另有研究显示蜂毒肽预防肝癌细胞转移可能与其抑制Rac1信号通路有关。有研究利用腺病毒作为载体将蜂毒肽基因导入肝脏肿瘤细胞后整合到肝癌细胞的基因组，使肝癌细胞的生长明显受到抑制。因为缺少蜂毒肽抗体，还不能从蛋白质水平确定蜂毒肽基因的表达。但是病毒Ad-rAFP-Mel显著抑制HepG2细胞生长，且有量效关系。

4.改变肿瘤的生存环境。原发性肿瘤若想在机体内生长和繁殖，必须要在于案发地组织周围形成新的血管，供给营养物质，并且这些血管也为肿瘤细胞的转移提供了有利条件。下调VEGF和β-FGF的表达，抑制肿瘤周围血管的生成可能会成为抗肿瘤的一种手段。有学者观察了蜂毒肽对骨肉瘤UNR-106细胞裸鼠移植瘤的影响，结果发现蜂毒肽治疗组的新生血管数量明显少于对照组，说明蜂毒肽能够抑制新生血管的形成。同时还有研究发现蜂毒肽对鸡胚绒毛尿囊膜的血管形成也有明显的抑制作用。因而有学者提出蜂毒肽对肿瘤的抑制作用可能与改变了肿瘤的生长环境有关——抑制周围血管的生成，是肿瘤细胞由于缺乏营养物质的供应而死亡，并且可以降低肿瘤细胞的侵袭能力。

三、蜂毒肽抗肿瘤的临床应用

1.组成杂合肽。蜂毒肽与天然抗菌肽形成的杂合肽不但具有很强的抗菌作用，而且在抗肿瘤方面也有很好的疗效。有学者利用肺癌细胞系对杂合肽的结构同抗菌作用和抗肿瘤的效果的关系进行研究时发现，当肽的18和19位残基均是碱性的K，16位残基是疏水的L或V时，抗肿瘤作用更强；第12位残基与溶血作用有关而与抗肿瘤作用无关；第4位的P使碱性程度增加从而增强了溶血作用，但抗肿瘤作用无明显改变。

2.将蜂毒肽制成免疫毒素。在免疫系统发挥作用的过程中，T淋巴细胞执行特异性细胞免疫的功能。由于杀伤性T细胞核抑制性体细胞的抗原决定簇相同，迟发型过敏发应T细胞和辅助性T细胞称为CD4，Th细胞和Tdth细胞称为CD8，通过测量经蜂毒肽治疗后的CD4和CD8的变化，可以测量出蜂毒肽分子对机体产生的影响。在一定程度上T细胞亚群可以作为免疫系统平衡标志的，CD4/CD8的比值在免疫学上常用来衡量免疫系统的稳定程度。蜂毒肽与T淋巴细胞亚群的作用是双向的，无论向哪个方向偏离，都会有回归正常范围的趋势。利用蜂毒肽治疗时，CD4细胞数量要比CD8细胞升高的早，但是经过一段时间的调整后，两者又恢复平衡状态，但是这种短暂地失衡对患者的影响不大。一直以来，蜂毒肽被认为是理想的免疫调节药物。但从疗效来看，CD4和CD8的变化范围越大，治疗的效果越显著。蜂毒肽对CD4/CD8影响，就是蜂毒肽双向免疫调节作用的证明。利用单克隆抗体的特异性，将蜂毒肽带到病灶以杀伤肿瘤细胞。将蜂毒肽分子与单克隆抗体通过化学键连接到一起，这样组成的偶联物既可以保留单克隆抗体对肿瘤细胞的特异性识别，又保留了蜂毒肽对肿瘤细胞的强烈的杀伤作用，降低了蜂毒肽对正常机体细胞的破坏力。将编码蜂毒肽的基因片段和编码抗体的基因片段构建成复合基因，然后将构建的符合基因导入大肠杆菌并整合到其基因组内予以表达。表达的产物克服了蜂毒肽对机体的非特异性杀伤，又可以借助单克隆抗体的精确定位作用大大提高蜂毒肽对肿瘤细胞的杀伤力。有人通过化学合成的方法合成蜂毒肽，去掉了蜂毒肽C端的4个氨基酸，使其能够形成α-螺旋结构，增强其水溶性，提高其溶血能力。

3.蜂毒肽类似物的研究。把天然蜂毒肽基因整合到pGEX-4T-2载体中，转染重组质粒pDEX-AccM的BL21。经诱导表达的产物蛋白占工程菌蛋白的15.2%，并且具有水溶性的占40%，蛋白的纯化提取均很方便。蜂毒肽基因虽为真核基因，但是由于其结构简单，含脱氧核苷酸的数目少，翻译的产物不用糖基化等修饰，在原核生物中表达的产物也具有很高的活性。

4.蜂毒肽基因直接导入到肿瘤细胞内。我们可以将蜂毒肽基因直接导入肿瘤细胞，让其表达的产物持续不断的对病灶给药，以达到杀死肿瘤细胞的作用。有人将蜂毒肽基因整合到腺病毒的基因组上，然后让重组的腺病毒侵染肝癌细胞，发现抑制肝脏肿瘤的效果明显。

四、蜂毒肽作为抗肿瘤药物存在的问题及解决的方法

蜂毒的成分十分复杂，各成分作用也不一样，如若使用不当，可引起过敏性水肿、过敏性休克等副作用。人工合成蜂毒肽单体的工艺烦琐，成本太高。因此提纯蜂毒肽的研究意义重大。传统提取蜂毒肽的方法是采用凝胶柱色谱加离子交换柱进行梯度洗脱，制得的蜂毒素组分中常含有磷脂酶A2等杂质，且梯度洗脱操作较烦琐。现代工艺选用单一流动相，采用多种规格的分离凝胶柱分3步进行分离纯化，这种工艺的洗脱速度适中，纯化过程较为省时，利用高效液相色谱对分离产物进行测定后发现，这种工艺较之传统工艺分离所得到的蜂毒素的纯度更高。由于蜂毒肽毒性较大，当用量过大时会对正常的机体组织造成一定的伤害，尤其是蜂毒肽的溶血作用，使用不当可能造成严重后果。这些不利因素限制的蜂毒肽的在临床应用上的推广。为了消除蜂毒肽的这些弊端，达到增效减毒的目的，有人将蜂毒肽溶于泊洛沙姆407中制成缓释剂。这种方法制成的缓释剂经试验证明其毒性明显低于单纯的蜂毒肽，经缓蚀剂处理过的肿瘤细胞的生长受到明显的抑制，肿瘤组织广泛坏死，处理后的肿瘤组织平均生存期延长，综合治疗作用优于单纯的蜂毒肽。这表明蜂毒肽缓蚀剂延长了蜂毒肽的作用时间，增强了蜂毒肽的抗肿瘤效果，并且单位时间内作用于机体的药量减少，降低了蜂毒肽对机体正常组织的毒害作用。除此之外，有人采用将蜂毒肽制备成蜂毒肽-聚乳酸羟乙酸微球，然后将其导入大鼠移植性肝癌部位，药物在肿瘤部位局部缓慢释放，使病灶部位的药物浓度高，但全身浓度却相对较低，这样不但增强了药物的对肿瘤的杀伤力，也起到了减毒的作用，效果明显优于单纯的蜂毒肽。

[1]李绍祥，凌昌全，刘新垣.携蜂毒素基因腺病毒感染对HepG2细胞CD54表达的影响[J].第一军医大学学报，2003，23（4）：300.

[2]刘岭，凌昌全，黄雪强.蜂毒素的纯化方法及体外抗肿瘤作用研究[J].中国生化药物杂志，2003，24（4）：163-166.

R979.1

A

1674-9324（2014）29-0140-03

河北省自然科学基金资助项目（C2012208069）；河北科技大学创新基金资助课题。

李迎涛，硕士研究生，研究方向：分子药理学。

王莉，博士，副教授，研究方向：分子药理学。