“绿色植物中色素的提取”实验仪器和技术的改进

曹宏梅+赖红伟+董顺福+韩丽琴+陶然

“绿色植物中色素的提取”是医学院校多个专业学生的必修实验，从实验材料、实验仪器、装柱方法以及洗脱剂的选用四个方面对此实验进行了改进，首先解决了实验材料的受限性，其次节约了实验教学的经费，再次简化了洗脱的步骤，最后避免了有毒试剂的危害，使得色素的提取实验取得了较好的效果。

绿色植物色素提取实验仪器实验技术改进一、改进的背景

有机化学实验中的“绿色植物中色素的提取”是医学院校临床医学、食品质量与安全、药学、药物制剂学、临床药学、生物技术、医学检验、临床输血、预防医学和市场营销等专业学生的一个必修实验。自2008年至2012年以来，笔者所在院校对此实验用新鲜菠菜叶作为实验材料，用层析柱作为柱色谱分离的仪器，用干法装柱，用9：1石油醚-丙酮、7∶3石油醚-丙酮和3∶1∶1正丁醇-乙醇-水分别作洗脱剂。这种实验方法，不仅色素分离的步骤繁琐，而且所用的化学试剂总类多、用量大，存在着诸多弊端，因此很有必要对此实验进行适当改进。

二、改进的内容

（一）改进实验材料

此实验用新鲜的菠菜叶作为实验材料，由于北方菠菜的种植易受季节的限制，经过大量的实验验证，可用韭菜、香菜、生菜、芹菜和空心菜等四季均可种植的蔬菜来代替菠菜。改进后，解决了此实验的材料具有局限性的弊端。

（二）改进柱色谱分离所用的实验仪器

改进前，柱色谱分离所用的实验仪器是层析柱。层析柱是一根下部带有活塞的玻璃管，这种结构特点使其在使用时存在一定的弊端：首先，身为玻璃仪器存在易被损坏的风险；其次，层析柱价格贵，每根50元；最后，用层析柱进行柱色谱分离，消耗的吸附剂用量较大。

改进后，用分析化学实验中淘汰下来的酸式滴定管代替层析柱进行柱色谱分离实验。笔者把分析化学实验中已破损、可利用的酸式滴定管收集起来，根据仪器实际损坏情况，一方面，可采取用酒精喷灯将酸式滴定管管口破损部位烧熔，进行钝化处理，以避免破损部位伤人，达到再利用的目的。另一方面，对于活塞损坏的酸式滴定管，可采取将收集的可用活塞和滴定管活塞套内壁多次重新配对，以使玻璃活塞配合紧密，达到可用状态。将损坏的酸式滴定管经相应处理后，替代层析柱用于柱色谱分离实验，这种实验仪器的改进不但没有影响柱色谱分离的实验效果，而且具有一定的优点：第一，解决了此实验层析柱造价高的弊端，减轻了学生赔偿仪器的经济压力。第二，降低了学校对此实验的仪器投入成本。第三，节约了吸附剂的使用量。本实验使用的吸附剂为中性氧化铝，改进前进行柱色谱分离时需要中性氧化铝80克，改进后仅消耗20克，大大减少了此实验所用试剂的经费投入。

（三）改进柱色谱分离技术

1.改进前的操作方法

改进前，用80g中性氧化铝在层析柱中采用干法装柱。加样，先用9∶1的石油醚–丙酮洗脱，当第一个橙黄色色带流出时，换一接收瓶接收，它是β-胡萝卜素。换用7:3的石油醚–丙酮洗脱，当第二个棕黄色色带流出时，换一次接收瓶接收，它是叶黄素。再换用3∶1∶1的正丁醇–乙醇–水洗脱，分别接收叶绿素a（蓝绿色）和叶绿素b（黄绿色）。此种色素分离方法缺点较多，如：干法装柱极易在中性氧化铝中形成气泡而影响色素分离效果，若发现柱中已有气泡存在，应该设法将其排除，若不能排掉，则应该倒出柱内物品重新装柱。另外分离色素时所用的正丁醇刺激性强，恶臭使人难忍，属低毒类物质，吞食有害，刺激呼吸系统和皮肤，对眼睛有严重伤害，其蒸汽使人头痛、头晕和困倦，不利于师生健康的同时还会污染环境。

2.改进后的柱色谱分离

柱色谱分离的改进内容：一方面将装柱方法由干法改进为湿法，另一方面将三种洗脱剂改进为只用9∶1的石油醚-丙酮一种。改进后，具体的柱色谱分离操作为：

1.先进行湿法装柱

将酸式滴定管竖直固定在铁架台上，关闭活塞，加入9∶1的石油醚–丙酮至滴定管容积的1/4，用干净的玻璃棒将少量脱脂棉推入滴定管底，挤出其中气泡，但不可压得太紧，否则洗脱剂9∶1的石油醚–丙酮将流出太慢或流不出来。将白沙加入滴定管中，使其在脱脂棉上均匀沉积约5mm厚。将20g中性氧化铝用9∶1的石油醚–丙酮在烧杯浸润并调成糊状。打开滴定管活塞，调节流速为1滴/秒，将调好的氧化铝在搅拌下自滴定管管口缓缓注入管中，同时用套有乳胶管的玻璃棒轻敲管身，使氧化铝均匀沉降，形成均匀紧密的氧化铝柱。加完氧化铝后，在其沉积面上盖一张直径与管内径相当的滤纸片。

2.后进行色素的洗脱

小心放出酸式滴定管中洗脱剂至液面下降到滤纸片处，关活塞，将样品沿管内壁缓慢加入，不可冲动氧化铝，否则会致使氧化铝表面不平而影响色素分离效果。样品加完后，开活塞，放液至液面降至滤纸片时，关活塞，在不冲动氧化铝的情况下，用少许洗脱剂冲洗管内壁，再放出液至液面降到滤纸处，再冲洗管内壁，直至管壁和所加洗脱剂没有颜色。始终保持氧化铝上面有一段液柱的情况下，不断加入9∶1的石油醚-丙酮洗脱，当第一个橙黄色色带流出时，换一接收瓶接收，它是β-胡萝卜素。当第二个棕黄色色带流出时，换一次接收瓶接收，它是叶黄素。当第三个蓝绿色色带流出时，换一次接收瓶接收，它是叶绿素a。当第四个黄绿色色带流出时，换一次接收瓶接收，它是叶绿素b。

3.经过大量的实验证明

柱色谱分离技术的改进在丝毫未影响以上四种色素的分离效果的同时，又可以简化不断更换三种洗脱剂的实验步骤；减少了实验技术人员所配试剂的种类；减少了有毒试剂用后回收处理的工作量；减少了有毒试剂对师生身体产生的毒害以及对环境的污染程度。

三、需注意的问题

首先，进行湿法装柱时，滴定管要垂直于实验台面；氧化铝要一次加完，若分多次加入，则因其沉积为多层，且各层交接处的氧化铝颗粒细，在分离色素时易被误认为是一个色素层；氧化铝的顶面要装平，否则易使色素带倾斜，不能接收到单一组分；在装柱时及装柱后，要始终保持氧化铝上面有一段洗脱剂柱，以避免空气进入氧化铝，在其内部形成气泡而影响分离效果。若发现管中已有气泡，应设法排除，防止发生断层和裂缝现象，若不能排除气泡，则应重新装柱。

其次，要避免样品溶液在加样时被冲稀，否则易造成色素带过宽，各色素的界限不清晰的后果。

最后，控制洗脱剂的流速为1滴/秒。流速太快或太慢都会影响分离效果。

参考文献：

[1]李富霞，王富余.“绿叶中色素的提取和分离”实验步骤的改进[J].生物学通报，2010，45（1）：49-50.

[2]王晶晶.绿叶中色素的提取和分离实验改进[J].教学仪器与实验，2012，28（7）：30-31.

[3]黄武强.“绿叶中色素的提取和分离”实验的改进[J].实验教学与仪器，2010，（11）：25.

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