微孔板法测定功能性饮料中的维生素B12

张艳 王骏等

摘 要：

通过样品处理比较试验、色素影响评价、回收率试验和重复性试验，得到了微孔板法测定功能性饮料中维生素B12的有效方法。经测定，该方法测定限可达到0.005 μg/L，1.0、2.0、20.0 μg/L三个梯度水平的加标回收率为94.4%～101.8%，实际样品测定中相对标准偏差为0.35%～4.34%（n=6），灵敏度和重复性很高，可用于测定功能性饮料中微量的维生素B12。

关键词：微孔板法；测定；功能性饮料；维生素B12

中图分类号：TS275.4+TS207.3 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2014）04-0110-04

功能性饮料是应特定人群的营养需求，通过添加维生素、矿物质等功能因子制作的饮品，属于特殊用途饮料类[1]，具有一定的保健功能。功能性饮料常添加各种维生素，如：烟酰胺、肌醇、维生素B6、维生素B12等[2，3]。其中，维生素B12能促进红细胞形成，参与人体内碳水化合物、脂肪和蛋白质的代谢，可维护人体神经系统的正常功能[4，5]，是功能性饮料中经常添加、极为重要的有效成分之一。

维生素B12测定方法主要有酶联免疫吸附法、化学分析法和微生物法[6]。维生素B12在功能饮料中的添加量通常为0.8～20.0 μg/L，酶联免疫吸附法（检测限3.9 μg/kg）[7]、高效液相色谱-紫外法（检测限1.0～4.4 μg/kg）[8，9]等化学分析法很难准确测定其含量；而原子吸收分光光度法（检测限5.0 ng/L）[10]、高效液相色谱-荧光光度法（检测限0.1 μg/L）[11]虽然有较高的灵敏度，但往往因功能性饮料基质复杂，样品净化难监控，对仪器测定干扰大，从而影响维生素B12的测定结果[6]。

微生物测定法灵敏度高，检测限可达到0.01 μg/L[12]，是进行微量维生素B12测定的理想方法。但微生物法操作繁琐、耗时长[6]，且实验重现性受微生物菌株活力、所用器皿清洁度、试验人员操作的影响较大[13，14]，亟需现代化的手段加以改善，以便广泛应用。为此，本试验用与现行国家标准测试原理相同的维生素B12测定试剂盒对功能性饮料中的维生素B12进行测定[15]，并通过试验对其前处理方法、准确性、精密度进行评定。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

试样为5种市售功能性饮料，维生素B12标识质量浓度分别为0.8、1.0、11.0、12.0、20.0 μg/L；维生素B12测定试剂盒[包括莱士曼氏乳酸杆菌（Lactobacillus leichmannii）包被的96孔微孔板、维生素B12标准品干粉、测试用培养基干粉、无菌蒸馏水、微孔板架]，德国IFP公司；微量移液器（100、200 μL及1 mL），德国Eppendorf公司；0.2 μm水相滤膜。

1.2 仪器与设备

xMark型酶标仪，美国Bio-Rad公司（精度0.001）；SHP-250型生化培养箱，上海精宏实验设备有限公司[（36±0.5）℃]；超净工作台，北京东联哈尔仪器公司；SX-500型高压蒸汽灭菌锅，日本TOMY公司；水浴锅。

1.3 方法

1.3.1 测试用培养基的配制 在维生素B12测试用培养基贮存瓶中加入10 mL无菌水，密封混匀后95℃水浴5 min，期间振荡混匀2次。水浴后迅速冷却至室温，用无菌滤膜过滤后备用。

1.3.2 样品的预处理 用无菌滤膜过滤后，根据试剂盒说明对样品滤液进行稀释，稀释倍数=标识质量浓度÷0.06×40（注：因处理过程中未对试样进行40倍稀释定容，需乘以40以纠正稀释倍数计算）。

95℃水浴加热组在过滤前于95℃水浴加热30 min，期间振荡混匀5次，水浴后迅速冷却至室温。

1.3.3 梯度标准溶液的配制 按试剂盒说明配制维生素B12标准品工作液，用无菌水对标准品原液进行梯度稀释，得到10%、20%、30%、40%、60%五个梯度的标准溶液，对应的维生素B12质量浓度分别为0.3、0.6、0.9、1.2、1.8 μg/L。

1.3.4 测定步骤 测定在超净工作台的无菌环境中进行。将适量微孔板条固定在微孔板架上，在每个微孔中先加入测试用培养基150 μL，再加入标准品溶液或样品稀释液150 μL，空白对照、标准品溶液、样品稀释液各做3个平行；加样完毕后，用配套黏合箔充分密封微孔板条，置于36℃培养箱中孵育44～48 h。

孵育完毕后，压实黏合箔上下颠倒微孔板3 min混匀，轻轻撕开黏合箔，除去气泡，在630 nm下读取吸光值A630。

1.4 标准曲线绘制与含量计算

以维生素B12质量浓度为横坐标，吸光度值A630为纵坐标绘制标准曲线[16]。根据得到的公式计算各微孔对应的维生素B12质量浓度。试样中维生素B12质量浓度的计算公式如下：

C=Cxf40

式中：C为试样中维生素B12质量浓度，单位μg/L；Cx为微孔对应的维生素B12质量浓度，单位μg/L；f为样品稀释倍数；40为稀释定容的纠正参数。

2 结果与分析

2.1 试样预处理方法比较

为评价95℃水浴处理对功能性饮料中维生素B12测定的影响，设计了试样1的95℃水浴加热组，与无加热处理组的测定结果进行比较，结果见表1。试样1的95℃水浴加热组与无加热处理组6次平行测定的平均值分别为2.221、2.230 μg/L，相对标准偏差为0.29%，在测定误差允许的范围内[17]，可忽略水浴加热对测定结果的影响。

2.2 试样中色素对测定结果的影响评价

功能性饮料的5个试样分别为淡紫色、无色、明黄色、淡黄色和橘红色的液体，而液体培养基为淡黄色。肉眼可见的颜色波长范围，橙色为597～622 nm，红色为622～770 nm[18]，而试样最终测定使用630 nm，因此需通过试验评价试样中色素对测定结果的影响。endprint

将5个试样分别稀释80、80、500、500和1 200倍，取各试样相应倍数稀释液和测试用培养基以1∶1的比例混匀，并测定A630，测试用培养基与无菌水的1∶1混合液作为空白对照，得到5个试样稀释液的A630分别为-0.003、-0.001、0.000、-0.002、0.001。而在维生素B12测定过程中，5个试样稀释液的A630在0.259～0.665之间，可见试样本身所含色素对最终A630的影响均小于1.2%，在酶标仪的测定误差范围内可以忽略不计。因此，功能性饮料无需进行色素去除就可用微孔板法测定维生素B12。

2.3 标准曲线的绘制与分析

以维生素B12标准溶液的质量浓度（μg/L）为横坐标，吸光度值A630为纵坐标绘制标准曲线，所得曲线方程Y=-0.3245X3+0.919X2-0.1604X+0.0958（相关系数R2=1.000）在0.3～1.8 μg/L范围内与实验数据拟合程度良好（图1）。

2.4 加标回收率试验

对试样1进行1.0、2.0、20.0 μg/L三个梯度水平的加标回收率试验，平行测定6次，结果（表2）显示，三个梯度的加标回收率为94.4%～101.8%，相对标准偏差为1.8%～4.9%，精密度满足<21%[17]的要求。该方法的准确度和精密度良好，结果可靠，可满足功能饮料中维生素B12含量的测定。

2.5 重复性试验

对5个试样进行6次平行测定，结果（表3）显示，5个功能性饮料的测定值相对标准偏差为0.35%～4.34%，均在5.0%之内，符合<21%[17]的要求。测定重复性好，可满足功能性饮料中维生素B12实际测定的要求。

3 结论

本试验利用莱士曼氏乳酸杆菌（Lactobacillus leichmannii）对维生素B12的特异性和灵敏性，采用微孔板法测定功能性饮料中的维生素B12。由于测定用培养基中不含维生素B12，微生物生长产生的吸光值同标准溶液及未知待测溶液中维生素B12的含量相对应[15]。本试验结果表明，加热处理和基质色素不影响测定结果，试验操作简便；所得标准曲线相关系数为1.000，拟合程度良好；加标回收率为94.4%～101.8%，实际样品测定时相对标准偏差为0.35%～4.34%（n=6），方法的精密度、准确度高，重复性好；该方法测定限可达到0.005 μg/L，灵敏度高，能满足功能性饮料中微量维生素B12测定对准确度的要求。

微孔板技术改善了微生物测定方法的不足之处[14，19]，因生产工艺规范，保证了均一的菌株接种量和生长活力，从而提高了试验的精密度、准确度和重复性；且微孔板的设计模式使试验操作更加简便，提高了工作效率。

参 考 文 献：

[1]

中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局. GB10789-2007饮料通则[S]. 北京：中国标准出版社，2007.

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[5] 叶芳青， 孙袁， 蒋小亚， 等. 孕妇血浆叶酸、维生素B12和同型半胱氨酸水平测定及临床意义[J]. 中国妇幼保健， 2006， 21（16）：2230-2232.

[6] 崔明， 杨大进， 鲁杰， 等. VB12检测技术研究进展[J]. 食品与发酵工业， 2011， 37（4）：166-171.

[7] Sharma R， Rajput Y S， Dogra G， et al. Estimation of vitamin B12 by ELISA and its status in milk[J]. Milchwissenschaft， 2007， 62（2）：127-130.

[8] Campos-Gimenez Esther，Fontannaz Patric，Trisconi Marie-Jose，et al.Determination of vitamin B12 in food products by liquid chromatography/UV detection with immunoaffinity extraction：single-laboratory validation[J].Journal of AOAC International，2008，91（4）：786-793.

[9] Marley E C， MacKay E， Young G. Characterization of vitamin B12 immunoaffinity columns and method development for determination of vitamin B12 in a range of foods， juices and pharmaceutical products using immunoaffinity clean-up and high performance liquid chromatography with UV detection[J]. Food Additives & Contaminants， 2009， 26（3）：282-288.

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[11]Li H B， Chen F. Determination of vitamin B12 in pharmaceutical preparation by a highly sensitive fluorimetric method [J]. Fresenius Journal of Analytical Chemistry， 2000， 368（8）：836-838.

[12]Watanabe F，Takenaka S，Abe K， et al. Comparison of a microbiological assay and a fully automated chemiluminescent system for the determination of vitamin B12 in food[J]. J. Agr. Food Chem.， 1998， 46（4）：1433-1436.

[13]陈亚波， 周敏， 杨彤. 微生物法测定维生素饮料中的维生素B12[J]. 浙江农业科学， 2013（7）：863-865.

[14]黄晓林， 王淼， 张丽宏， 等. IFP微孔板试剂盒检测配方乳粉中维生素B12方法探讨[J]. 中国乳品工业， 2010，38（7）：48-49.

[15]中华人民共和国卫生部. GB5413.14-2010 婴幼儿食品和乳品中维生素B12的测定[S]. 北京：中国标准出版社， 2010.

[16]唐靓， 李跃中， 王晗， 等. 国标《食品中叶酸的测定》的标准曲线的绘制与计算[J]. 中国卫生检验杂志， 2009， 19（7）： 1682-1683.

[17]中国合格评定国家认可中心. GB/T27404-2008实验室质量控制规范 食品理化检测[S]. 北京： 中国标准出版社， 2008.

[18]马文蔚等著. 物理学（下册） [M]. 第5版. 北京： 高等教育出版社， 2006： 161-179.

[19]张旺， 邹志飞， 袁慕云. 微孔板试剂盒法检测婴幼儿配方奶粉中叶酸质量分数[J]. 中国乳品工业， 2013， 41（2）：59-64.endprint

将5个试样分别稀释80、80、500、500和1 200倍，取各试样相应倍数稀释液和测试用培养基以1∶1的比例混匀，并测定A630，测试用培养基与无菌水的1∶1混合液作为空白对照，得到5个试样稀释液的A630分别为-0.003、-0.001、0.000、-0.002、0.001。而在维生素B12测定过程中，5个试样稀释液的A630在0.259～0.665之间，可见试样本身所含色素对最终A630的影响均小于1.2%，在酶标仪的测定误差范围内可以忽略不计。因此，功能性饮料无需进行色素去除就可用微孔板法测定维生素B12。

2.3 标准曲线的绘制与分析

以维生素B12标准溶液的质量浓度（μg/L）为横坐标，吸光度值A630为纵坐标绘制标准曲线，所得曲线方程Y=-0.3245X3+0.919X2-0.1604X+0.0958（相关系数R2=1.000）在0.3～1.8 μg/L范围内与实验数据拟合程度良好（图1）。

2.4 加标回收率试验

对试样1进行1.0、2.0、20.0 μg/L三个梯度水平的加标回收率试验，平行测定6次，结果（表2）显示，三个梯度的加标回收率为94.4%～101.8%，相对标准偏差为1.8%～4.9%，精密度满足<21%[17]的要求。该方法的准确度和精密度良好，结果可靠，可满足功能饮料中维生素B12含量的测定。

2.5 重复性试验

对5个试样进行6次平行测定，结果（表3）显示，5个功能性饮料的测定值相对标准偏差为0.35%～4.34%，均在5.0%之内，符合<21%[17]的要求。测定重复性好，可满足功能性饮料中维生素B12实际测定的要求。

3 结论

本试验利用莱士曼氏乳酸杆菌（Lactobacillus leichmannii）对维生素B12的特异性和灵敏性，采用微孔板法测定功能性饮料中的维生素B12。由于测定用培养基中不含维生素B12，微生物生长产生的吸光值同标准溶液及未知待测溶液中维生素B12的含量相对应[15]。本试验结果表明，加热处理和基质色素不影响测定结果，试验操作简便；所得标准曲线相关系数为1.000，拟合程度良好；加标回收率为94.4%～101.8%，实际样品测定时相对标准偏差为0.35%～4.34%（n=6），方法的精密度、准确度高，重复性好；该方法测定限可达到0.005 μg/L，灵敏度高，能满足功能性饮料中微量维生素B12测定对准确度的要求。

微孔板技术改善了微生物测定方法的不足之处[14，19]，因生产工艺规范，保证了均一的菌株接种量和生长活力，从而提高了试验的精密度、准确度和重复性；且微孔板的设计模式使试验操作更加简便，提高了工作效率。

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将5个试样分别稀释80、80、500、500和1 200倍，取各试样相应倍数稀释液和测试用培养基以1∶1的比例混匀，并测定A630，测试用培养基与无菌水的1∶1混合液作为空白对照，得到5个试样稀释液的A630分别为-0.003、-0.001、0.000、-0.002、0.001。而在维生素B12测定过程中，5个试样稀释液的A630在0.259～0.665之间，可见试样本身所含色素对最终A630的影响均小于1.2%，在酶标仪的测定误差范围内可以忽略不计。因此，功能性饮料无需进行色素去除就可用微孔板法测定维生素B12。

2.3 标准曲线的绘制与分析

以维生素B12标准溶液的质量浓度（μg/L）为横坐标，吸光度值A630为纵坐标绘制标准曲线，所得曲线方程Y=-0.3245X3+0.919X2-0.1604X+0.0958（相关系数R2=1.000）在0.3～1.8 μg/L范围内与实验数据拟合程度良好（图1）。

2.4 加标回收率试验

对试样1进行1.0、2.0、20.0 μg/L三个梯度水平的加标回收率试验，平行测定6次，结果（表2）显示，三个梯度的加标回收率为94.4%～101.8%，相对标准偏差为1.8%～4.9%，精密度满足<21%[17]的要求。该方法的准确度和精密度良好，结果可靠，可满足功能饮料中维生素B12含量的测定。

2.5 重复性试验

对5个试样进行6次平行测定，结果（表3）显示，5个功能性饮料的测定值相对标准偏差为0.35%～4.34%，均在5.0%之内，符合<21%[17]的要求。测定重复性好，可满足功能性饮料中维生素B12实际测定的要求。

3 结论

本试验利用莱士曼氏乳酸杆菌（Lactobacillus leichmannii）对维生素B12的特异性和灵敏性，采用微孔板法测定功能性饮料中的维生素B12。由于测定用培养基中不含维生素B12，微生物生长产生的吸光值同标准溶液及未知待测溶液中维生素B12的含量相对应[15]。本试验结果表明，加热处理和基质色素不影响测定结果，试验操作简便；所得标准曲线相关系数为1.000，拟合程度良好；加标回收率为94.4%～101.8%，实际样品测定时相对标准偏差为0.35%～4.34%（n=6），方法的精密度、准确度高，重复性好；该方法测定限可达到0.005 μg/L，灵敏度高，能满足功能性饮料中微量维生素B12测定对准确度的要求。

微孔板技术改善了微生物测定方法的不足之处[14，19]，因生产工艺规范，保证了均一的菌株接种量和生长活力，从而提高了试验的精密度、准确度和重复性；且微孔板的设计模式使试验操作更加简便，提高了工作效率。

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