埃及品系尼罗罗非鱼不同选育世代间遗传潜力分析

王腾+肖炜+李大宇+邹芝英+祝璟琳+乐贻荣+杨弘

摘要：选用25个微卫星基因座对连续3个选育世代的埃及品系尼罗罗非鱼进行检测，通过分析世代间的遗传差异来探讨埃及品系尼罗罗非鱼的保种现状和遗传潜力。结果表明，3个世代群体在25个微卫星基因座中共检测出105个等位基因，不同基因座上的等位基因数为2～7，3个世代群体的平均有效等位基因数（Ae）分别为2.59、2.52、230个，平均期望杂合度（He）分别为0.547、0.545、0.518，平均观测杂合度（Ho）分别为0.479、0.457、0.451，平均多态信息含量（PIC）分别为0.487、0.480、0.458，3个世代群体遗传多样性水平较高，世代间各遗传参数随世代数增长呈略微下降趋势，但差异不显著（P>0.05）；3个世代间遗传分化指数（Fst）在0.017～0.048之间，均小于0.05，遗传分化程度相对较低；通过分子方差对遗传变异来源分析表明，经过选育群体世代间的遗传分化较小，世代间变异仅占总变异的334%，分化主要来源于世代内个体间的遗传差异。目前，采用保种选育方法对埃及品系尼罗罗非鱼世代间的遗传信息较为稳定，具有较高的遗传潜力。

关键词：埃及品系；尼罗罗非鱼；选育世代；微卫星；遗传多样性；遗传潜力

中图分类号： S917.4文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）02-0184-04

收稿日期：2013-07-29

基金项目：现代农业产业技术体系专项（编号：CARS-49）；中央级公益性科研院所基本科研业务费专项（编号：2013JBFM01）；现代农业人才支撑计划（编号：2130106）。

作者简介：王腾（1990—），女，山东临沂人，硕士，研究方向为鱼类遗传育种。E-mail：wangteng0416@163.com。

通信作者：杨弘（1966—），男，江苏无锡人，研究员，主要从事鱼类育种工作。E-mail：yangh@ffrc.cn。尼罗罗非鱼（Orechromis niloticus）原产于非洲，具有生长速度快、食性杂及抗病力强等优点，是联合国粮农组织（FAO）向世界各国推荐的主要养殖品种之一。自1978年引进我国以来，罗非鱼养殖在我国得到迅速发展，现已成为我国淡水养殖的重要品种。优良的苗种是保证罗非鱼成鱼品质的关键，因此，良种的选择和培育是保障优良苗种供给、实现我国罗非鱼产业稳定发展的决定性因素。为此，1999年，中国水产科学研究院淡水渔业研究中心从埃及农业和农垦部水产研究中心实验室引进尼罗罗非鱼基础群体5 000尾，在南泉养殖基地采用闭锁群体继代选育法，以生长速度和尾鳍条纹为主要选择目标，2年1个世代，选择总强度为30%左右。经过多年选育，该群体生长、经济性状进一步得到提高，现已成为1个新的优良品系[1]。目前，群体选育法已经较多地用于罗非鱼的选育工作，往往重视经济性状的选择，在分子水平上对遗传变化的跟踪研究却较少，忽略了群体遗传型变化可能会导致遗传多样性的降低，从而降低遗传效应，造成遗传瓶颈效应。

近年来，分子标记技术已经广泛应用于水产动物的亲缘关系鉴定、物种多样性检测、种质资源的保护以及基因连锁图谱的构建和基因定位等领域[2-5]，在开展品种选育时，对群体遗传结构影响的研究也有一些成果。Romana-Eguia等利用微卫星标记对尼罗罗非鱼不同选育世代的研究、Patricia等利用RAPD技术对不同世代凡纳滨对虾群体遗传多样性的分析，结果均显示选育世代遗传多样性有逐代降低的趋势[6-7]；颉晓勇等对吉富品系尼罗罗非鱼选育群体遗传变异分析发现，随着选育的进行，群体遗传参数逐渐降低，群体呈现出纯化趋势[8]。本研究拟采用微卫星标记对埃及品系尼罗罗非鱼3个世代保种群遗传变异进行检测，初步评价埃及品系尼罗罗非鱼在现有选育方式下的保种现状及遗传潜力，了解尼罗罗非鱼在保种选育过程中遗传型的变化，为制定更加合理有效的保种方案提供理论依据，为其他品种的引种和保种工作提供参考。

1材料与方法

1.1试验材料

1.2方法

1.2.1基因组DNA的制备采用常规酚-氯仿法制备基因组DNA，并通过琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测其浓度和纯度，稀释至100 ng/μL，作为PCR扩增的模板。

1.2.2微卫星引物的设计本研究中使用的引物均从已发表的尼罗罗非鱼遗传连锁图谱中选取[9]，按照互不连锁的原则，从不同的连锁群中选择具有多态性的25个微卫星基因座，相关信息见表1。引物由上海申能博彩公司合成。

1.2.3PCR扩增及电泳检测反应体系：10×Buffer（Mg2+ Free）2.5 μL，MgCl2（25 mmol/L）1.5 μL，微卫星上下游引物（10 μmol/L）各1.5 μL，dNTP（2.5 mmol/L）2 μL，Taq-DNA聚合酶1 U，DNA模板（100 ng/μL）1 μL，补无菌去离子水至25 μL。反应程序：94 ℃变性5min；94 ℃变性30 s，各引物 55～62 ℃ 复性30 s，72 ℃延伸35 s，30个循环；最后72 ℃延伸10 min。

1.3 数据分析

使用PopGene 1.32软件计算每个群体的等位基因数（observed number of alleles，Na）、有效等位基因数（effective number of alleles，Ae）、观测杂合度（observed heterozygosity，Ho）、期望杂合度（expected heterozygosity，He）、群体间遗传距离（genetic distance，Ds）和遗传相似性系数（genetic similarity index，I）。利用ARLEQUIN 3.1软件，计算群体遗传分化指数Fst，估计群体间的遗传分化，分析群体内和群体间的分子方差（AMOVA）。根据Botstein等计算多态信息含量（polymorphism information content，PIC）[10]，PIC计算公式为：PIC=1-（∑ni=1P2i）-（∑n-1i=1∑nj=i+12P2iP2j）。式中，n为某一位点上等位基因数，Pi、Pj分别为第i和第j个等位基因在群体中的频率，j=i+1。endprint

2结果与分析

2.1PCR扩增结果

采用25对微卫星引物对3个世代共84尾样本进行分析比较。由表2可见，25个基因座在3个群体中共检测到了105个等位基因，大多集中在100～300 bp之间，不同基因座位上的等位基因数在2～7个之间，平均每个基因座上的等位基因数为4.2个。采用12%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，得到清晰且重复性较好的产物。图1所示为引物GM277分别在3个群体中的扩增图谱。

2.23个世代间的遗传多样性

由表3可见，3个世代的平均有效等位基因数（Ae）分别为2.59、2.52、2.30，平均期望杂合度（He）分别为0.547、0545、0.518，平均观测杂合度（Ho）分别为0.479、0457、0451，平均多态信息含量（PIC）分别为0.487、0.480、0.458，3个罗非鱼保种选育群体的遗传多样性均属于中度偏高水平。其中，F1代遗传多样性最高，F3代最低，呈现出略微下降的趋势。经t检验P>0.05，3世代间无明显差异。

2.33个世代间的遗传差异

3个罗非鱼群体间的Neis遗传距离（Ds）和遗传相似系数见表4。在F1、F2、F3 3个世代中，F1和F3的遗传距离最大，为0.077，遗传相似系数最小，为0.926，说明两者亲缘关系较远；F2与F3的遗传距离最小，为0.040，遗传相似系数最大，为0.961，说明两者亲缘关系较近。

Wright认为，遗传分化指数Fst≤0.05表示群体间遗传分化微弱；0.05

3小结与讨论

3.1埃及尼罗罗非鱼各世代保种群的遗传分析

通过对埃及品系尼罗罗非鱼3个世代保种选育群体进行遗传多样性检测，对遗传多样性参数进行比较，结果显示，3个罗非鱼选育群体平均多态信息含量（PIC）分别为0.487、0480、0.458，均处于中度偏高的遗传多样性水平[10]，与Hassanien等研究埃及尼罗罗非鱼5个野生群体遗传多样性得出的结果（Ae=8.4、Ho=0.702、He=0.869）[12]相比，这3个罗非鱼选育群体的遗传多样性水平较低（Ae=2.47、Ho=0.462、He=0.537），这可能与引种后尼罗罗非鱼为人工养殖群体，并且经历了选育有关。Macaranas等对尼罗罗非鱼非洲野生群体和亚洲养殖群体进行了遗传差异分析发现，养殖群体遗传多样性高于野生群体，推测是由于尼罗罗非鱼养殖群体与莫桑比克罗非鱼发生了渐渗杂交的原因[13]。本试验尼罗罗非鱼遗传多样性虽然低于其他学者的研究结果，但其遗传多样性仍处于较高水平，3个保种世代群体的遗传多样性有逐代降低的趋势，世代间无明显差异（P>0.05），这反映了埃及品系尼罗罗非鱼保种群体的遗传多样性得到了很好的保存，保种选育效果较好。

埃及品系尼罗罗非鱼从F1至F3代遗传差异很小（Fst<0.05），通过分子方差对遗传变异来源分析，经过人工选育，群体世代间遗传分化并不大，世代间变异仅占总变异的334%，分化主要来源于世代内个体间的遗传差异。F3与F2之间的分化小于F2与F1之间的分化，推测相邻世代间的分化随着世代增加可能呈现出逐渐降低的趋势，群体遗传结构逐渐趋于稳定。从 3个选育世代间的遗传距离和遗传相似性结果可以看出，随着选育的进行，F2、F3与 F1之间的遗传距离逐渐增大，而遗传相似性系数逐渐减小，这表明埃及品系尼罗罗非鱼经过3代群体选育，人工选择压力在一定程度上改变了选育群体的遗传结构，部分基因座上等位基因频率发生改变，可以获得具有更稳定遗传水平的选育良种。

3.2保种选育方法的可行性探讨

保种就是有效地控制群体的近交和遗传漂变，尽可能多地保存群体原有的基因和杂合度，群体规模是决定保种效果的基本因素[14]。为了避免种群中某些基因的丢失，生产单位多以大量的群体进行保种和引种。2003年，广西水产研究所从南京农业大学无锡渔业学院引进埃及品系尼罗罗非鱼种苗51 360尾，经多代选育已获得较为理想的苗种繁育亲本[15]，其遗传多样性也得到了良好的保存[16]。从维持种群遗传多样性的角度来讲，保留群体的规模越大越好，而在实际生产中，如果保留群体规模过大，就不可避免造成人力、物力资源的大量浪费。本研究以雌鱼600尾、雄鱼300尾进行保种，群体规模较小，亲鱼群体有效大小可达500尾以上，近交增量在0.1%以内，理论上可基本避免近亲交配[17-18]。从微卫星检测结果来看，埃及尼罗罗非鱼保种群体遗传多样性得到了很好的保存，本研究的保种选育方法具有一定的可行性，由于受选育保种数目所限，选育世代遗传多样性发生了一定程度的变化和下降。另外，本研究仅通过微卫星标记对3个世代进行了遗传方面的分析和探讨，还应结合生长指标、血液生化指标等其他生物学指标对保种效果进行进一步分析，从而制定出更为合理有效的保种方案。

参考文献：

[1]夏德全 .论罗非鱼产业发展[J]. 海洋与渔业，2003（8）：7-9.

[2]Naish K A，Skibinski D O F. Tetranucleiotide microsatellites loci for Indian major carp[J]. Journal of Fish Biol，1998，53（4）：886-889.

[3]王婷婷，宋学宏，许爱国，等. 应用微卫星标记分析4个黄颡鱼群体的遗传多样性[J]. 江苏农业科学，2012，40（4）：41-45.

[4]Banks M A，Blouin M S，Baldwin B A，et al. Isolation and inheritance of novel microsatellites in chinook salmon（Oncorhynchus tschawytscha）[J]. The Journal of Heredity，1999，90（2）：281-288.

[5]Kocher T D，Lee W J，Sobolewska H，et al. A genetic linkage map of a cichlid fish，the tilapia（Oreochromis niloticus）[J]. Genetics，1998，148（3）：1225-1232.

[6]Romana-Eguia M R，Ikeda M，Basiao Z U，et al. Genetic changes during mass selection for growth in Nile tilapia，Oreochromis niloticus（L.），assessed by microsatellites[J]. Aquaculture Research，2005，36（1）：69-78.

[7]Patricia D F，Pedrom M J. Assessment of the genetic diversity in five generations of a commercial broodstock line of Litopenaeus vannamei shrimp[J]. African Journal of Biotechnology，2005，4（12）：1362-1367.

[8]颉晓勇，李思发，蔡完其. 吉富品系尼罗罗非鱼选育过程中遗传变异的微卫星分析[J]. 水产学报，2007，31（3）：385-390.

[9]Lee B Y，Lee W J，Streelman J T，et al. A second-generation genetic linkage map of tilapia（Oreochromis spp.）[J]. Genetics，2005，170（1）：237-244.

[10]Botstein D，White R L，Skolnick M，et al. Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms[J]. American Journal of Human Genetics，1980，32（3）：314-331.

[11]Wright S. Evolution and the genetics of populations[M]. Chicago：University of Chicago Press，1978：1-30.

[12]Hassanien H A，Gilbey J. Genetic diversity and differentiation of Nile tilapia（Oreochromis niloticus）revealed by DNA microsatellites[J]. Aquaculture Research，2005，36（14）：1450-1457.

[13]Macaranas J M，Agustin L Q，Ablan M A，et al. Genetic improvement of farmed tilapias：biochemical characterization of strain differences in Nile tilapia[J]. Aquaculture International，1995，3（1）：43-54.

[14]Wright S. Evolution in mendelian populations[J]. Genetics，1931，16（2）：97-157.

[15]曹谨玲，陈剑杰，杨弘，等. 埃及品系尼罗罗非鱼的选育及其效果分析[J]. 水生生物学报，2010，34（4）：866-871.

[16]肖炜，杨弘，李大宇，等. 同种罗非鱼（Tilapia）不同地区选育群体的遗传多样性分析[J]. 海洋与湖沼，2010，41（4）：530-537.

[17]李思发. 鱼类繁育群体遗传性能的保护[J]. 水产学报，1988，12（3）：283-290.

[18]Franklin I R. Evolutionary change in small populations[C]//Soule M E，Wilcox B A. Conservation biology：An evolutionary-ecological perspective. Sunderland：Sinauer Associate，1980：135-150.endprint

[5]Kocher T D，Lee W J，Sobolewska H，et al. A genetic linkage map of a cichlid fish，the tilapia（Oreochromis niloticus）[J]. Genetics，1998，148（3）：1225-1232.

[6]Romana-Eguia M R，Ikeda M，Basiao Z U，et al. Genetic changes during mass selection for growth in Nile tilapia，Oreochromis niloticus（L.），assessed by microsatellites[J]. Aquaculture Research，2005，36（1）：69-78.

[7]Patricia D F，Pedrom M J. Assessment of the genetic diversity in five generations of a commercial broodstock line of Litopenaeus vannamei shrimp[J]. African Journal of Biotechnology，2005，4（12）：1362-1367.

[8]颉晓勇，李思发，蔡完其. 吉富品系尼罗罗非鱼选育过程中遗传变异的微卫星分析[J]. 水产学报，2007，31（3）：385-390.

[9]Lee B Y，Lee W J，Streelman J T，et al. A second-generation genetic linkage map of tilapia（Oreochromis spp.）[J]. Genetics，2005，170（1）：237-244.

[10]Botstein D，White R L，Skolnick M，et al. Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms[J]. American Journal of Human Genetics，1980，32（3）：314-331.

[11]Wright S. Evolution and the genetics of populations[M]. Chicago：University of Chicago Press，1978：1-30.

[12]Hassanien H A，Gilbey J. Genetic diversity and differentiation of Nile tilapia（Oreochromis niloticus）revealed by DNA microsatellites[J]. Aquaculture Research，2005，36（14）：1450-1457.

[13]Macaranas J M，Agustin L Q，Ablan M A，et al. Genetic improvement of farmed tilapias：biochemical characterization of strain differences in Nile tilapia[J]. Aquaculture International，1995，3（1）：43-54.

[14]Wright S. Evolution in mendelian populations[J]. Genetics，1931，16（2）：97-157.

[15]曹谨玲，陈剑杰，杨弘，等. 埃及品系尼罗罗非鱼的选育及其效果分析[J]. 水生生物学报，2010，34（4）：866-871.

[16]肖炜，杨弘，李大宇，等. 同种罗非鱼（Tilapia）不同地区选育群体的遗传多样性分析[J]. 海洋与湖沼，2010，41（4）：530-537.

[17]李思发. 鱼类繁育群体遗传性能的保护[J]. 水产学报，1988，12（3）：283-290.

[18]Franklin I R. Evolutionary change in small populations[C]//Soule M E，Wilcox B A. Conservation biology：An evolutionary-ecological perspective. Sunderland：Sinauer Associate，1980：135-150.endprint

[5]Kocher T D，Lee W J，Sobolewska H，et al. A genetic linkage map of a cichlid fish，the tilapia（Oreochromis niloticus）[J]. Genetics，1998，148（3）：1225-1232.

[6]Romana-Eguia M R，Ikeda M，Basiao Z U，et al. Genetic changes during mass selection for growth in Nile tilapia，Oreochromis niloticus（L.），assessed by microsatellites[J]. Aquaculture Research，2005，36（1）：69-78.

[7]Patricia D F，Pedrom M J. Assessment of the genetic diversity in five generations of a commercial broodstock line of Litopenaeus vannamei shrimp[J]. African Journal of Biotechnology，2005，4（12）：1362-1367.

[8]颉晓勇，李思发，蔡完其. 吉富品系尼罗罗非鱼选育过程中遗传变异的微卫星分析[J]. 水产学报，2007，31（3）：385-390.

[9]Lee B Y，Lee W J，Streelman J T，et al. A second-generation genetic linkage map of tilapia（Oreochromis spp.）[J]. Genetics，2005，170（1）：237-244.

[10]Botstein D，White R L，Skolnick M，et al. Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms[J]. American Journal of Human Genetics，1980，32（3）：314-331.

[11]Wright S. Evolution and the genetics of populations[M]. Chicago：University of Chicago Press，1978：1-30.

[12]Hassanien H A，Gilbey J. Genetic diversity and differentiation of Nile tilapia（Oreochromis niloticus）revealed by DNA microsatellites[J]. Aquaculture Research，2005，36（14）：1450-1457.

[13]Macaranas J M，Agustin L Q，Ablan M A，et al. Genetic improvement of farmed tilapias：biochemical characterization of strain differences in Nile tilapia[J]. Aquaculture International，1995，3（1）：43-54.

[14]Wright S. Evolution in mendelian populations[J]. Genetics，1931，16（2）：97-157.

[15]曹谨玲，陈剑杰，杨弘，等. 埃及品系尼罗罗非鱼的选育及其效果分析[J]. 水生生物学报，2010，34（4）：866-871.

[16]肖炜，杨弘，李大宇，等. 同种罗非鱼（Tilapia）不同地区选育群体的遗传多样性分析[J]. 海洋与湖沼，2010，41（4）：530-537.

[17]李思发. 鱼类繁育群体遗传性能的保护[J]. 水产学报，1988，12（3）：283-290.

[18]Franklin I R. Evolutionary change in small populations[C]//Soule M E，Wilcox B A. Conservation biology：An evolutionary-ecological perspective. Sunderland：Sinauer Associate，1980：135-150.endprint