电针对慢性应激抑郁大鼠海马CNTF Rα、EGFR蛋白表达的影响

胡 诚 王 晶 张丹妹 史榕荇 包伍叶 宋映周 卢 俊 图 娅 邬继红

(1 北京中医药大学针灸推拿学院，北京，100029; 2 世界中医药学会联合会，北京，100101; 3 中日友好医院针灸科，北京，100029)

电针对慢性应激抑郁大鼠海马CNTF Rα、EGFR蛋白表达的影响

胡 诚1王 晶2张丹妹1史榕荇3包伍叶1宋映周1卢 俊1图 娅1邬继红1

(1 北京中医药大学针灸推拿学院，北京，100029; 2 世界中医药学会联合会，北京，100101; 3 中日友好医院针灸科，北京，100029)

目的：观察电针对抑郁大鼠海马睫状神经营养因子受体(CNTF Rα)、表皮生长因子受体(EGFR)蛋白表达的影响，探讨慢性应激抑郁模型(CUMS)大鼠星形胶质细胞功能的改变及电针的干预作用趋势。方法：雄性SD大鼠随机分为4组：空白组、模型组、模型+电针组、模型+氟西汀组，每组10只。利用生物素标记蛋白芯片技术，检测大鼠CNTF Rα、EGFR蛋白的表达。结果：模型组与空白组比较，大鼠海马CNTF Rα、EGFR蛋白表达上调(fold change=1.50，1.37)。模型+电针组、模型+氟西汀组与模型组比较，CNTF Rα水平下调(fold change=0.73，0.50)，EGFR表达水平下调(fold change=0.61，0.47)。结论：各组大鼠海马CNTF Rα、EGFR的表达存在差异性，这可能是星形胶质细胞功能改变及针刺抗抑郁的机制之一。

电针;抑郁症;慢性应激;海马;星形胶质细胞

抑郁症是一种常见的精神疾患，主要表现为显著而持久的心境低落，思维行为改变，并伴有躯体症状[1]。电针治疗抑郁症可起到减轻躯体症状、降低抗抑郁药物不良反应的作用，并且针药结合使用，还可使疗效叠加[2]。针刺治疗抑郁症已成为临床中的重要组成部分，显示出了较大的优势，但其作用途径较复杂，且尚没有统一的定论。本研究首次利用生物素标记蛋白芯片技术，筛选出与星形胶质细胞功能变化相关的睫状神经营养因子受体(CNTF Rα)、表皮生长因子受体(EGFR)，旨在丰富针刺治疗抑郁症的机制研究。

1 材料与方法

1.1 动物 健康雄性SD大鼠(200±20)g，清洁级，共40只。由北京华阜康生物科技股份有限公司提供，许可证编号：SCXK(京)2004-2007。所有动物在实验前适应性喂养1周，实验室温度(23±1)℃、湿度55%～60%。

1.2 主要试剂和仪器电针仪 (华佗牌，SDZ-II型);氟西汀(Fluoxetine hydrochloride，法国礼来公司，批号：J20120001);AAR-BLM-1试剂盒(美国RayBiotech公司，芯片批号：4015806、4015807)：包括膜芯片(RayBio® Biotin label-based Rat antibody array 1)、标记试剂、终止液、封闭缓冲液、红外荧光剂—链霉亲和素、透析管和浮漂、20X的洗液I、20X的洗液II、纯化柱、孵育盒;红外荧光扫描仪(Licor-Odyssey，美国LI-COR公司)。

1.3 方法

1.3.1 模型制备 对参考文献的造模方法进行改进[3]。除空白组外，其余3组大鼠进行28 d各种不同的应激刺激，包括：断食24 h;断水24 h;夜间光照12 h;冷水游泳(4 ℃，5 min，水深30 cm);潮湿垫料;夹尾2 min;束缚3 h。

1.3.2 动物分组 采用随机数字表的方法将大鼠分为空白组、模型组、模型+电针组、模型+氟西汀组，每组10只。空白组动物自由摄食饮水，不接受任何刺激且群养。其他3组动物孤养，且每天进行慢性应激造模处理。其中，模型+电针组动物每日在应激刺激前1 h，进行电针干预。模型+氟西汀组动物每日在应激刺激前1 h，进行氟西汀灌胃干预。

1.3.3 针刺方法 取穴：针刺穴位参考《实验针灸学》[4]，选取“百会”“印堂”穴。操作：针具选用30号1寸毫针(2.5 cm)，平刺进针，深度为0.5～1 cm。进针后，接电针治疗仪，以大鼠头部微颤为宜，留针20 min/次。

1.3.4 给药方法 将药物溶于蒸馏水中，给药容积为5 mL/kg体重，用药剂量10 mg/kg体重。

1.4 取材及检测方法 于慢性应激4周后，灌流，取脑放入液氮中，然后转移到-80 ℃冰箱保存待测。1)样品透析：将每组的10个大鼠海马组织混合，取200 μL组织裂解液加入透析管中，然后在4 000 mL的1×PBS(pH=8)中4 ℃边搅拌边透析。更换透析液1次/3 h。2)测定蛋白浓度：采用BCA试剂盒(Pierce公司，货号：23227)检测淋巴液蛋白浓度。3)生物素标记：将标记试剂小管快速离心，管中加入500 μL 1×PBS溶解粉末，上下吹打将标记试剂混匀，制备成1×标记试剂溶液;向新的离心管中加入适当量的标记试剂，快速混匀，此后，每5 min轻弹离心管以混合反应试剂，摇床上室温孵育30 min;加入5 μL终止液，用纯化柱去除未与芯片上蛋白结合的生物素;将柱子放入50 mL收集管中;于3 000 r/min离心机离心3 min，去掉储存液，重复两次此操作后，清洗干净柱子;将柱子放入一个新的50 mL离心管中，缓慢将标记好的样品加入树脂床的中央。4)封闭和孵育：用镊子拖着膜或者夹着膜的边缘将膜缓慢浸没到2.5 mL的封闭缓冲液中，有标志的面朝上，避免气泡产生，盖上孵育盒的盖子，室温振荡孵育1 h;用抽液泵抽去封闭液，每张膜芯片加入2.5 mL封闭液稀释好的样品，盖上盖子，包上塑料薄膜，4 ℃环境下过夜;抽去样品，每个孵育盒中加入约3 mL的1×洗液I(20×洗液用去离子水稀释)室温振荡洗膜，洗膜4次，5 min/次;抽去1×洗液I，加入1×洗液II室温振荡洗膜，洗膜3次，5 min/次;抽去1×洗液II，每张膜加入2.5 mL用封闭液8 000倍稀释的CW800-链霉亲和素;室温避光振荡孵育2 h;洗膜(步骤同上)。5)扫描：使用美国LI-COR公司的LI-COR Odyssey Scanner进行扫描，设定波长为800扫描通道，扫描强度intensity为7.0，分辨率为42 μm。采用仪器自带分析软件提取数据，采用AAR-BLM-1的数据分析软件来进行数据预分析。

2 结果

4周应激处理后，与空白组相比，模型组大鼠海马CNTF Rα表达上调(fold change=1.50);相较于模型组，模型+电针组、模型+氟西汀组CNTF Rα表达下调(fold change=0.73，0.50)。见图1。

图1 各组海马CNTF Rα的表达

与空白组相比，模型组大鼠海马EGFR蛋白的表达上调(fold change=1.37);与模型组相比，模型+电针组、模型+氟西汀组EGFR表达下调(fold change=0.47)。见图2。

图2 各组海马EGFR的表达

3 讨论

3.1 星形胶质细胞与抑郁症 星形胶质细胞(Astrocyte，AST)，作为中枢神经系统中数量最多、分布最广的一类细胞，是神经元的支持细胞。在突触重塑、神经细胞再生、神经元调节方面，AST也起着重要的作用[5]。AST与情绪障碍性疾病的发生有着密切的联系。Czeh等[6]对成年雄性树鼩进行5周心理应激，发现其海马AST总数减少，胞体体积减小。Lori L[7]等用磁共振成像技术观察包括抑郁障碍的情绪障碍性疾病患者，发现其星型胶质细胞密度减少。AST在脑损伤中起着双重作用。郭志慧等[8]认为，脑组织受损后释放多种因子激活了AST，而活化的AST在早期对神经元有保护作用，另一方面，也通过释放多种损伤因子对神经元产生毒性。姜硕等[9]建立抑郁大鼠模型并用针刺治疗发现，模型大鼠AST明显减少，针刺干预后AST增多。

3.2 关于指标的选择 生物素标记蛋白芯片技术具有实用性强、快速、准确、高通量、高灵敏度等特点[10]。弥补了基因组研究不能获得对疾病状态进行了解的缺陷。本课题应用生物素标记蛋白芯片技术，共检测出大鼠90个蛋白的表达情况。着重关注了CNTF Rα和EGFR两个指标。CNTF Rα是睫状神经营养因子(CNTF)的特异性结合蛋白质。KAHN等[11]发现体外培养的AST表面均有CNTF受体的表达。EGFR具有络氨酸激酶活性。有研究表明[8]，AST活化后，EGFR表达明显上调，而抑制EGFR会抑制AST的活化。此外，何健等[12]认为，AST被激活后，细胞表面的CNTF Rα、EGFR超表达，通过改善复杂的内环境，有利于定向诱导神经干细胞向神经元分化。这对进一步探讨抑郁状态下AST功能的变化及针刺干预的影响，完善针刺抗抑郁的机制研究有着重要的意义。

通过检索发现，国内研究多重复AST特异性标记物胶原纤维酸性蛋白(GFAP)的表达与AST功能的关系，而少有其他相关蛋白的报道。生物素标记蛋白芯片技术为我们提示了CNTF Rα、EGFR蛋白差异性变化的趋势，但对于所筛选的蛋白的可靠性和二者的作用及影响机制，还有待实验和临床的进一步验证和完善。

[1]Yu S，Holsboer F，Almeida O F.Neuronal actions of glucocorticoids： focus on depression[J].J Steroid Biochem mol Biol，2008，108(3-5)：300-309.

[2]段冬梅，图娅，陈利平.电针与百优解对伴躯体症状抑郁症有效性的评价[J].中国针灸，2008，28(3)：167-170.

[3]戴巍，李卫东，卢峻，等.电针对慢性应激抑郁大鼠海马神经元凋亡及JNK信号转导通路的影响[J].针刺研究，2010，35(5)：330-334.

[4]张露芬.实验动物学[M].北京：化学工业出版社，2010：150-156.

[5]张敬军.星形胶质细胞的研究[J].中国药理学通报，2006，22(7)：788-791.

[6]Czeh B，Simon m，Schmelting B，et al.Astroglial plasticity in the hippocampus is affected by chronic psychosocial stress and concomitant fluoxetine treatment[J].Neuropsychopharmacology，2006，31(8)：1616-1626.

[7]Altshuler，LL，Abulseoud OA，Foland-Ross L，et al.Amygdala Astrocyte Reduction in Subjects with major Depressive Disorder but Not Bipolar Disorder[J].Bipolar Disorders，2010，12(5)：541-549.

[8]郭志慧，武衡.星形胶质细胞活化与表皮生长因子受体表达的相关性研究[J].中风与神经疾病杂志，2010，27(8)：683-685.

[9]姜硕.电针修复慢性应激致抑郁大鼠海马星形胶质细胞损伤的机制研究[D].广州：广州中医药大学，2013.

[10]田浩梅，易受乡.抗体蛋白芯片技术应用研究进展[J].湖南中医药大学学报，2009，29(3)：75-78.

[11]KAHN m A，HUANG C J，CARUSO A.Ciliary neurotrophic factor activates JAK/STAT signal transduction cascade and induces transcriptional expression of glial fibrillary acidic protein in glial cells[J].J Neurochem，1997，68(4)：1413-1423.

[12]何健，尹宗生，高维陆，等.大鼠表皮生长因子、睫状神经营养因子真核表达载体的构建及其体外表达的鉴定[J].中国组织工程研究，2012，16(23)：4284-4289.

(2014-02-12收稿 责任编辑：王明)

Influence of Electro-acupuncture on CNTF Rα、EGFR protein expression in rats with chronic stress depression

Hu Cheng1，Wang Jing2，Zhang Danmei1，Shi Rongxing2，Bao Wuye1，Song Yingzhou1，Lu Jun1，Tu Ya1，Wu Jihong1

(1SchoolofAcu-moxibustionandTuina，BeijingUniversityofChinesemedicine，Beijing100029，China;2WorldFederationofChinesemedicineSocieties，Beijing100101，China; 3China-JapanFriendshipHospital，Beijing100029，China)

Objective：To observe the effect of electroacupuncture on ciliary neurotrophic factor receptor and epidermal growth factor receptor of the hippocampal in the depression model rats.Methods：SD rats were randomly divided into four groups： blank group，model group，model+EA group，and model+ fluoxetine.Use biotin-labeled protein chip technology to detect the expression of CNTF Rα and EGFR.Results：Compared to the blank group，the protein expression of CNTF Rα and EGFR in the model group are upregulation.Compared to the model group，CNTF Rα and EGFR expression are downregulation in model+EA group and model+ fluoxetine group.Conclusion：The different expression of CNTF Rα and EGFR in each group may be one of the mechanisms of antidepressant by acupuncture.

Electro-acupuncture;Depression;Chronic Stress;Hippocampus;Astrocyte

国家自然科学基金面上项目(编号：81173334);北京中医药大学2013年校级自主课题(编号：0100604217)

邬继红(1964.4—)，女，硕士研究生，教授，研究方向：影响针灸疗效相关因素的研究，E-mail：wujihong@sohu.com

R245.9+7

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2014.05.024