反向、巢式、降落PCR技术克隆奥尼罗非鱼MSTN基因3′侧翼序列

李景芬+采克俊+曹访+孙君艳+梅杨玲

摘要：为获得奥尼罗非鱼侧翼MSTN基因的3′未知序列以完成奥尼罗非鱼MSTN基因全序列的克隆，采用反向、巢式、降落等3种PCR 技术对该未知序列进行克隆，对克隆到的序列进行测序，并与已有的奥尼罗非鱼MSTN基因核苷酸序列进行比对，获得MSTN基因3′端1 376 bp 新序列，从而完成奥尼罗非鱼MSTN基因全序列的克隆，为奥尼罗非鱼MSTN基因功能的进一步研究以及奥尼罗非鱼的分子育种研究奠定基础。说明反向、巢式、降落PCR相结合是扩增已知基因侧翼序列行之有效的方法。

关键词：反向PCR；巢式PCR；降落PCR；奥尼罗非鱼；MSTN基因；3′侧翼序列

中图分类号： S917文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）02-0028-03

收稿日期：2013-07-05

基金项目：浙江省自然科学基金 （编号：Y3110432、Y3090561）；浙江省钱江人才计划（编号：2012R10076 ）；浙江省公益性技术应用研究计划（编号：2011C37078）；浙江省重点创新团队项目（编号：2012R10026-05）。

作者简介：李景芬（1977—），女，浙江湖州人，博士，主要从事分子生物学方面的研究。E-mail：lijingfen@hutc.zj.cn。奥尼罗非鱼（Oreochromis niloticus×O.aureus）为奥利亚罗非鱼父本同尼罗罗非鱼母本杂交获得的良种，雄性率高，生长速度快，群体产量高，且抗病力强。因其肉白、富弹性、刺少而被称为“白色三文鱼”，是联合国粮农组织向世界各国推荐养殖的优良水产品之一，也是全球旺销的水产品之一[1]。肌肉生长抑制素（MSTN，简称抑肌素）基因是转录生长因子β（TGF-β）家族的一个成员，最先在小鼠中发现[2]，并且已有研究证明该基因是哺乳动物骨骼肌生长发育的负调控因子。有研究表明，该基因的功能在鱼与哺乳动物上一致，即均可抑制骨骼肌生长，如转基因斑马鱼因MSTN被抑制而使肌纤维数量明显增加[3]；通过RNA干扰沉默MSTN基因的斑马鱼表现出体型巨大化[4]；MSTN基因显性失活形式的过表达导致转基因青鳉的肌纤维数量在成年后加倍[5]；青鳉MSTN基因的缺失，在幼鱼后期到成鱼初期表现为肌纤维数量的增加，随后出现肌纤维的肥大，呈现“双肌”表型[6]。因此，笔者选择反向、巢式、降落3种PCR技术克隆奥尼罗非鱼MSTN基因的3′侧翼序列，以有效获得这一未知序列，完成奥尼罗非鱼MSTN基因全序列的克隆，从而为研究奥尼罗非鱼MSTN基因功能和分子育种奠定基础。

1材料与方法

1.1试验材料

供试的奥尼罗非鱼由浙江省淡水水产研究所提供。限制性内切酶BamHⅠ、XhoⅠ、XbaⅠ、NcoⅠ、BglⅡ、HindⅢ，T4 DNA连接酶，rTaq DNA 聚合酶，dNTP，DL 2000 DNA Marker、琼脂糖、大肠杆菌DH5α及质粒载体pMD19-T vector均购自TaKaRa 公司。AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒、AxyPrep 质粒小量制备试剂盒、AxyPrep PCR Clean-up kit 均购自爱思进生物技术（杭州）有限公司。此外，还有EDTA、苯酚、三氯甲烷、异戊醇等。

1.2试验方法

1.2.1DNA的提取采用经典的苯酚-三氯甲烷法提取鱼血DNA。2.0 μL DNA 样品进行1.0%琼脂糖凝胶电泳，再结合紫外分光光度计法检测所提取的DNA 的重量和浓度。

1.2.2DNA的酶切参照限制性内切酶说明书进行酶切试验，分别采用BglⅡ、XhoⅠ、NcoⅠ、BamHⅠ、HindⅢ、XbaⅠ 等6 种限制性内切酶对基因组DNA 进行酶切，酶切反应总体积为40 μL，37 ℃水浴酶切18 h。用电泳检测酶切效果，之后用AxyPrep PCR Clean-up kit 进行纯化，用20 μL ddH2O洗脱以去除限制性内切酶。

1.2.3酶切片段的连接与酶切片段的连接环化参照T4 DNA 连接酶说明书进行连接，反应体系为100 mL[包括 82 μL ddH2O、10 μL T4 DNA Ligase Buffer、6 μL 酶切产物（>50 ng/μL）和2 μL T4 DNA 连接酶]，16 ℃连接21 h，再用AxY PrepTM PCR Clean up kit 进行纯化，以10 μL ddH2O 洗脱，获得5个酶切库。

1.2.4引物设计与PCR 扩增已克隆到的奥尼罗非鱼MSTN基因序列设计引物，由上海英骏公司合成。反向、巢式PCR第1轮引物： 1S为5′-CTTCTTCCCTGTTGTCATCTCCCAGCAC-3′，1A为5′ -CTACCCACTCACTGTGGACTTCGAGGAC-3′；第2轮引物：2S为5′-TCGTACTGATCCAGAAGCTGCTGCA-3′，2A为5′-CCCCAACAAAGATGTCGCCAATCAA-3′。引物1S和1A分别以各酶切库为模板进行第1轮反向、巢式、降落PCR，PCR体系 50 mL 包括10 PCR Buffer 5 μL、10 mmol/L dNTP 4 μL、10 pmol/μL 1S 4 μL；10 pmol/μL 1A 4 μL、25 ng/μL 模板 2 μL、5 U/μL rTaq 0.4 μL、ddH2O 30.6 μL。扩增程序：95 ℃ 预变性4 min；95 ℃ 变性30 s，73、71、69、67、65、63、61 ℃退火40 s，72 ℃ 延伸3 min，每个退火温度均如此循环3次；95 ℃变性30 s；55 ℃ 退火40 s，72 ℃延伸3 min，30个循环；72 ℃延伸 10 min。PCR结束后电泳。

对PCR产物进行30倍稀释，以稀释后的PCR产物为第2轮PCR的模版，PCR体系、程序同第1轮，只是引物为2S、2A，模版为4 μL，ddH2O 28.6 μL。PCR结束后电泳。

1.2.5PCR产物克隆与测序用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒回收和纯化PCR 扩增的目的片段。将纯化的DNA 片段与pMD-19T Vector连接，构建重组质粒，转化感受态大肠杆菌DH5α，PCR 法筛选重组子，摇匀，用AxyPrep质粒小量制备试剂盒提取质粒，双酶切（BamHⅠ、HindⅢ）鉴定正确后送往上海英骏公司测序。

1.2.6序列分析采用DNAman 软件进行序列分析，与GenBank 数据库的相关序列进行核苷酸序列同源性比较。

2结果与分析

2.1奥尼罗非鱼MSTN基因3′侧翼序列的扩增与克隆

基因组DNA分别采用BglⅡ、XhoⅠ、NcoⅠ、BamHⅠ、HindⅢ和XbaⅠ进行酶切，结果见图1。由图1可知，X泳道的基因组没切开，应舍弃；其余酶切较好，从上到下可看见弥散的条带，分别纯化后连接作为PCR的模板库。第1轮反向、巢式、降落PCR 扩增结果见图2，未获得特异性的PCR条带。第2轮反向、巢式、降落PCR 扩增结果见图3，从BglⅡ库中扩增到约1 450 bp的特异性条带，从NcoⅠ库中扩增出约 960 bp 的特异性目的条带，而从BamHⅠ、XhoⅠ和XbaⅠ库中均未扩增出特异性目的条带。将所获得的2条特异性目的条带进行克隆测序，将测序所获得的序列与已有的奥尼罗非鱼MSTN基因序列进行核苷酸序列比对，获得3′端1 376 bp 新序列。

2.2奥尼罗非鱼MSTN基因新获得序列分析

将所获得的新序列在网上进行在线Blast分析，该新序列与莫桑比克罗非鱼的MSTN基因序列相似度为99%，与点带石斑鱼和加州鲈的MSTN基因序列相似度为85%，与尼罗尖吻鲈的MSTN基因序列相似度为81%。目前已经得到了奥尼罗非鱼MSTN基因的全部序列，并已提交给GenBank，序列号为KC583258。

3结论与讨论

反向PCR技术是由Ochman等研究开发的[7-8]，主要用

于扩增与已知DNA序列相临的未知DNA序列。对含有已知序列及其相邻未知序列的基因组DNA样品用一种在已知序列中无酶切位点的限制性内切酶进行酶切，再用T4 DNA连接酶使酶切片段连接环化，之后以环化的DNA库为模板，用一对与已知序列两端特异性结合的引物向夹在中间的未知序列部分进行扩增。该方法在很多研究中都有应用[7-12]，本研究利用该方法也成功得到了奥尼罗非鱼MSTN基因3′端 1 376 bp 的未知序列。

巢式PCR在医学检测和分子生物学方面研究应用较多[13-16]。该方法的原理是设计2对引物，第1次PCR采用能扩增较大片段的引物，扩增结束后，采用能扩增较小片段的引物，以第1次扩增的产物为模板进行第2次扩增，以增强扩增的特异性。本研究设计了2对引物，先用扩增较大片段的引物进行扩增，结果如图2所示，未扩增到单一的目的条带；再用扩增较小片段的引物以第1次扩增产物为模板进行第2次扩增，结果如图3所示，得到了非常单一、特异性的目的条带，达到了试验的目的。由此可见，巢式PCR能有效获得特异性目的片段。

降落PCR是一种多循环PCR，其原理是：随循环数增加，退火温度逐渐降低，当退火温度低于解链温度（Tm≈10 ℃）时，则固定于该退火温度进行扩增，从而达到最佳扩增效果[17-18]。起始退火温度可高于Tm（约为5 ℃），然后每个循环降低1～2 ℃或每几个循环降低1～2 ℃，直到退火温度低于Tm（约为10 ℃）。尽管退火温度最终降低到非特异性杂交的Tm，但此时目的扩增产物已开始几何扩增，在剩余循环中超过任何非特异性产物的扩增量。虽然降落 PCR 程序复杂，但能非常有效地降低或避免假阳性[19]，尤其对那些不了解的引物和目的模版匹配程度，比如在用简并引物进行扩增时，笔者就曾经利用降落PCR、简并引物顺利克隆了草鱼的PKR基因[20]。对于Tm 相近的PCR反应可在同一循环条件下进行，可大大提高工作效率[21]。对不确定退火温度基因的扩增而言，这是首选[22]。由此可见，降落PCR在基因克隆上有较强的优势，可用于普通PCR难以扩增的基因片段。反向PCR结合巢式PCR在低拷贝甚至是单拷贝基因的侧翼序列克隆时，可显示其较好的特异性和灵敏度[23]。本试验联合使用这3种PCR，有效获得了奥尼罗非鱼MSTN基因的3′侧翼这一未知序列，完成了奥尼罗非鱼MSTN基因全序列的克隆。

从本试验顺利成功的实施可以看出，反向、巢式、降落PCR相结合是扩增已知基因侧翼序列行之有效的方法。如只采用反向PCR（图2）不能获得目的条带，但结合巢式PCR就得到了特异性目的条带。但反向、巢式PCR相结合，用普通的PCR程序进行扩增，本研究没有扩增到到任何条带，而在此基础上采用降落PCR后扩增到了目的条带，说明3种PCR技术相结合可有效获得目的条带，提高效率。另外，该方法比较经济，避免了使用RACE法的高昂费用。笔者计算过该方法涉及到的试剂费用约需2 500元，而完成该试验每种试剂只用了一点点；而RACE法只1个10次的3′RACE试剂盒就2 000元左右。再者，该方法操作严格度低，虽然步骤繁琐，但都是在DNA上进行的，操作严格度相对宽松；而RACE法的对象是RNA，操作与DNA相比相对比较严格。由此可见，反向、巢式和降落PCR技术相结合是克隆已知基因旁侧序列经济、有效并可广泛使用的好方法，为科研工作者提供了克隆已知基因旁侧序列的新途径。

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