地黄耐百草枯的有效成分分析

杨德亮　徐凤　刘秀　张闯　吴明根

摘要：地黄对百草枯除草剂具有较强的耐性，为了解地黄耐百草枯的有效成分，分别以300 g/hm2或600 g/hm2的百草枯处理地黄。结果表明，处理后10 d，药害等级分别为0级和2级，且药害症状恢复较快；当百草枯与地黄提取液或毛蕊花糖苷标准样品混合处理大豆幼苗时，百草枯对大豆叶片的药害症状减轻，说明地黄提取物或毛蕊花糖苷具有解除百草枯氧化毒性的功能。地黄叶片和块根中黄酮含量分别为2.29%和1.59%，毛蕊花糖苷的含量分别是7015、0.475 mg/g，叶片中的含量多于块根。

关键词：百草枯；地黄；黄酮；毛蕊花糖苷；耐药性

中图分类号：S451.2文献标志码：A文章编号：1002-1302（2014）01-0100-02

收稿日期：2013-05-20

基金项目：国家自然科学基金（编号：31160370）。

作者简介：杨德亮（1987—），男，吉林长春，硕士研究生，从事农田杂草防除研究。E-mail：dely1987@foxmail.com。

通信作者：吴明根（1958—），男，吉林龙井人，博士，教授，从事农田杂草防除研究。Tel：（0433）02435566；E-mail：5minggen@163.com。百草枯（Paraquat）属于高氧化活性的灭生性除草剂，在土壤中易失去活性，无残留[1]。地黄（Rehmannia glutinosa L.）[2]为玄参科地黄属植物，是传统的中药植物资源。前期研究结果表明，地黄生长期具有耐除草剂百草枯特性[3-4]，地黄乙醇提取物具有清除DPPH自由基能力的抗氧化特性[5]，地黄等玄参科植物提取物——梓醇、毛蕊花糖苷、多糖等具有清除DPPH自由基的能力[6-7]。因此，本试验进行地黄提取物以及毛蕊花糖苷对减轻百草枯除草剂的药害特征分析，揭示地黄耐百草枯除草剂的机理。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1供试植物地黄（Rehmannia glutinosa L.）品种为河北省引种品种（代号85-5）。大豆品种为黑农48。

1.1.2供试除草剂与试剂 百草枯：20% 克无踪由先正达南通作物保护有限公司提供。芸香苷标准品：由广州威佳科技有限公司提供，毛蕊花糖苷标准品由上海源叶生物科技有限公司提供；甲酸和甲醇为色谱纯；亚硝酸钠、95%乙醇、硝酸铝、99.5%乙醚、氢氧化钠均为分析纯。

1.1.3供试仪器液相色谱仪（Agilent 1100型），电子分析天平（CPA324S型），轨道震荡培养箱（SI500型），分光光度计（UV-1700 PharmaSpec型），减压旋转蒸发仪（EYEL4型）和索氏提取器等。

1.2试验方法

1.2.1地黄耐百草枯特性观察地黄出苗后20 d进行百草枯田间茎叶处理，剂量分别为300、600 g/hm2，以喷清水处理为对照。各处理重复3次，小区面积0.01 hm2。施药后10、20、40 d分别调查药害症状。

1.2.2地黄提取物和毛蕊花糖苷标准品的百草枯解毒性测定将20%百草枯1 mL与不同量的地黄块根提取液混合，加水定容至 100 mL，利用微型喷雾器均匀喷洒到长出2个复叶的大豆叶片上，施药后20 d分别调查药害症状观察。

将不同浓度的百草枯分别与不同浓度的毛蕊花糖苷标样混合配比后均匀涂抹在大豆叶片上，处理后20 d肉眼观察症状。

1.2.3地黄体内总黄酮含量的测定总黄酮类标准曲线制作：称取芸香苷5.0 mg，用60%乙醇定容至50 mL，得浓度为 0.1 mg/mL 的标准溶液。准确吸取标准溶液0、1.0、2.0、30、4.0、5.0 mL，分别加入30%乙醇至5 mL。再加0.3 mL 5% NaNO2 溶液，摇匀放置6 min；再加0.3 mL 10% Al（NO3）3 溶液，摇匀放置6 min；再加1 mol/L NaOH溶液4 mL，再加 0.4 mL 水，摇匀，放置10～15 min；于510 nm波长处测定吸光度，绘制芸香苷浓度（C）与吸光度（D）的标准曲线。

地黄提取、待测液的配制：将新鲜地黄叶片（7月9日取样）和块根（10月18日取样）在60 ℃烘干箱中烘干72 h。叶片采用索氏提取法，以无水99.5%乙醚为脱脂剂，于43 ℃水浴中脱脂除去脂类和脂溶性色素，再将其置于烘干箱中 130 ℃ 烘干备用。称取干燥地黄块根和叶片粉末样品各1份0.5 g，于50 mL锥形瓶中，分别加70%乙醇，以50 ℃水浴浸提4 h，过滤，得测定样液。准确吸取样液2.5 mL，稀释到 50 mL，再吸取5 mL于试管中，加0.3 mL 5% NaNO2 溶液，摇匀，放置 6 min，再加0.3 mL 10% Al（NO3）3 溶液，摇匀，放置 6 min，再加1 mol/L NaOH溶液4 mL，再加0.4 mL蒸馏水，摇匀，放置10～15 min，同时作空白试剂为对照，于510 nm波长处测定吸光度，通过查标准曲线，计算出地黄叶片和块根的总黄酮含量。

样品中的黄酮量=CV1V21V3V4m×1/10（1）

式中：V1为第1次定容的体积（mL）；V2为第2次定容的体积（mL）；V3为从第1次定容后的溶液中取出来进行第2次定容的体积（mL）；V4为从第二次定容后的溶液中取出来进行测定的体积（mL）；m为样品质量（g）。

1.2.4地黄体内毛蕊花糖苷含量的测定洗脱程序：Zorbax C18色谱柱（4.6 m×250 mm，5 μm），流速1 mL/min，检测波长为332 nm，以0.5 %甲酸溶液为流动相A，甲醇为流动相B，按表1中的规定进行梯度洗脱。

标准样品溶液的制备：称取毛蕊花糖苷标样3.0 mg，加入3 mL流动相，制成1 mg/mL的溶液，将其稀释至0.25 mg/mL。

地黄待测样品溶液的制备：称取地黄干块根粉末0.8 g和捣碎叶片3 g，分别加甲醇50 mL，称质量，震荡24 h，静止后再称质量，加甲醇补足，摇匀，过滤，精密量取滤液20 mL，减压回收溶剂近干，用流动相溶解残渣，转移至5 mL量瓶中，并用流动相稀释至刻度，摇匀，过滤，取滤液，即为待测液。

样品含量测定：液相色谱检测后按公式（2）计算样品中毛蕊花糖苷的含量。

毛蕊花糖苷含量=A样品×C对照品×j对照品1A对照品×m样品1V×j样品（2）

式中：A为峰面积；j为进样量；C为对照品纯度；m为样品质量；V为样品定容体积。

2结果与分析

2.1百草枯处理对地黄、大豆的药害

2.2地黄体内总黄酮含量

在510 nm波长处测定芸香苷标准样品不同浓度（C）与吸光度（D）值，得到D=1.020 6C-0.015 5线性关系（图1），其线性范围为0～0.05 mg/mL，r2=0.991 8。通过样品中的黄酮量计算公式（1）计算出地黄块根、叶的黄酮含量分别为159%和2.29%，叶片中的黄酮含量高于块根（表5）。

3结论

毛蕊花糖苷是一种很强的抗氧化剂，在动物细胞中已经证实它具有防止脂质过氧化的能力[9]。高剂量百草枯对大豆叶片产生药害，而地黄提取液和毛蕊花糖苷标准品对大豆叶片无影响，当地黄提取液或毛蕊花糖苷标准品与百草枯混合处理大豆叶片时，百草枯对大豆叶片无药害，说明地黄耐百草枯氧化的有效成分之一是毛蕊花糖苷。

地黄块根和叶的黄酮含量分别为1.59%和2.29%，且叶片中的黄酮含量高于块根；地黄叶片的毛蕊花糖苷含量分别为7.015 mg/g和0.475 mg/g，说明地黄叶片中毛蕊花糖苷含量高于块根中的含量。

参考文献：

[1]朴仁哲，赵洪颜，金玉姬. 地黄田特用除草剂百草枯的初步研究[J]. 农药，2008，47（4）：288-289，291.

[3]Jae C C，Sang Y M. Physiological response of Rehmannia glutinosa to paraquat and its tolerance mechanisms[J]. Pesticide Biochemistry and Physiology，1997，59：51-63.

[4]武宝开，Mitchell E D，Johnson B L，等. 野生种花生叶片内超氧化物歧化酶及其抗百草枯特性[J]. 植物生理学报，1990，16（2）：147-152.

[5]赵洪颜，林昊，金玉姬，等. 地黄叶片提取物抗氧化活性及其薄层色谱的初步研究[J]. 安徽农业科学，2009，37（4）：1458-1459，1462.

[6]李寒冰，苗静静，李根林，等. 生、熟地黄的体外抗氧化活性测定方法研究[J]. 中国医药指南，2012，10（9）：393-395.

[7]苗明三，孙艳红，方晓艳. （怀）熟地黄多糖抗氧化作用[J]. 中国中医药信息杂志，2002，9（10）：32-33.

[8]魏福香. 除草剂药害试验方法[J]. 杂草科学，1992（3）：18-21.

[9]Liu M J，Li J X，Guo H Z，et al. The effects of verbascoside on plasma lipid peroxidation level and erythrocyte membrane fluidity during immobilization in rabbits：a time course study[J]. Life Sciences，2003，73（7）：883-892.戈林泉，王芳，吴进才. 2种选择性农药的使用对稻纵卷叶螟产卵及生理生化的影响[J]. 江苏农业科学，2014，42（1）：102-105.

地黄待测样品溶液的制备：称取地黄干块根粉末0.8 g和捣碎叶片3 g，分别加甲醇50 mL，称质量，震荡24 h，静止后再称质量，加甲醇补足，摇匀，过滤，精密量取滤液20 mL，减压回收溶剂近干，用流动相溶解残渣，转移至5 mL量瓶中，并用流动相稀释至刻度，摇匀，过滤，取滤液，即为待测液。

样品含量测定：液相色谱检测后按公式（2）计算样品中毛蕊花糖苷的含量。

毛蕊花糖苷含量=A样品×C对照品×j对照品1A对照品×m样品1V×j样品（2）

式中：A为峰面积；j为进样量；C为对照品纯度；m为样品质量；V为样品定容体积。

2结果与分析

2.1百草枯处理对地黄、大豆的药害

2.2地黄体内总黄酮含量

在510 nm波长处测定芸香苷标准样品不同浓度（C）与吸光度（D）值，得到D=1.020 6C-0.015 5线性关系（图1），其线性范围为0～0.05 mg/mL，r2=0.991 8。通过样品中的黄酮量计算公式（1）计算出地黄块根、叶的黄酮含量分别为159%和2.29%，叶片中的黄酮含量高于块根（表5）。

3结论

毛蕊花糖苷是一种很强的抗氧化剂，在动物细胞中已经证实它具有防止脂质过氧化的能力[9]。高剂量百草枯对大豆叶片产生药害，而地黄提取液和毛蕊花糖苷标准品对大豆叶片无影响，当地黄提取液或毛蕊花糖苷标准品与百草枯混合处理大豆叶片时，百草枯对大豆叶片无药害，说明地黄耐百草枯氧化的有效成分之一是毛蕊花糖苷。

地黄块根和叶的黄酮含量分别为1.59%和2.29%，且叶片中的黄酮含量高于块根；地黄叶片的毛蕊花糖苷含量分别为7.015 mg/g和0.475 mg/g，说明地黄叶片中毛蕊花糖苷含量高于块根中的含量。

参考文献：

[1]朴仁哲，赵洪颜，金玉姬. 地黄田特用除草剂百草枯的初步研究[J]. 农药，2008，47（4）：288-289，291.

[3]Jae C C，Sang Y M. Physiological response of Rehmannia glutinosa to paraquat and its tolerance mechanisms[J]. Pesticide Biochemistry and Physiology，1997，59：51-63.

[4]武宝开，Mitchell E D，Johnson B L，等. 野生种花生叶片内超氧化物歧化酶及其抗百草枯特性[J]. 植物生理学报，1990，16（2）：147-152.

[5]赵洪颜，林昊，金玉姬，等. 地黄叶片提取物抗氧化活性及其薄层色谱的初步研究[J]. 安徽农业科学，2009，37（4）：1458-1459，1462.

[6]李寒冰，苗静静，李根林，等. 生、熟地黄的体外抗氧化活性测定方法研究[J]. 中国医药指南，2012，10（9）：393-395.

[7]苗明三，孙艳红，方晓艳. （怀）熟地黄多糖抗氧化作用[J]. 中国中医药信息杂志，2002，9（10）：32-33.

[8]魏福香. 除草剂药害试验方法[J]. 杂草科学，1992（3）：18-21.

[9]Liu M J，Li J X，Guo H Z，et al. The effects of verbascoside on plasma lipid peroxidation level and erythrocyte membrane fluidity during immobilization in rabbits：a time course study[J]. Life Sciences，2003，73（7）：883-892.戈林泉，王芳，吴进才. 2种选择性农药的使用对稻纵卷叶螟产卵及生理生化的影响[J]. 江苏农业科学，2014，42（1）：102-105.

地黄待测样品溶液的制备：称取地黄干块根粉末0.8 g和捣碎叶片3 g，分别加甲醇50 mL，称质量，震荡24 h，静止后再称质量，加甲醇补足，摇匀，过滤，精密量取滤液20 mL，减压回收溶剂近干，用流动相溶解残渣，转移至5 mL量瓶中，并用流动相稀释至刻度，摇匀，过滤，取滤液，即为待测液。

样品含量测定：液相色谱检测后按公式（2）计算样品中毛蕊花糖苷的含量。

毛蕊花糖苷含量=A样品×C对照品×j对照品1A对照品×m样品1V×j样品（2）

式中：A为峰面积；j为进样量；C为对照品纯度；m为样品质量；V为样品定容体积。

2结果与分析

2.1百草枯处理对地黄、大豆的药害

2.2地黄体内总黄酮含量

在510 nm波长处测定芸香苷标准样品不同浓度（C）与吸光度（D）值，得到D=1.020 6C-0.015 5线性关系（图1），其线性范围为0～0.05 mg/mL，r2=0.991 8。通过样品中的黄酮量计算公式（1）计算出地黄块根、叶的黄酮含量分别为159%和2.29%，叶片中的黄酮含量高于块根（表5）。

3结论

毛蕊花糖苷是一种很强的抗氧化剂，在动物细胞中已经证实它具有防止脂质过氧化的能力[9]。高剂量百草枯对大豆叶片产生药害，而地黄提取液和毛蕊花糖苷标准品对大豆叶片无影响，当地黄提取液或毛蕊花糖苷标准品与百草枯混合处理大豆叶片时，百草枯对大豆叶片无药害，说明地黄耐百草枯氧化的有效成分之一是毛蕊花糖苷。

地黄块根和叶的黄酮含量分别为1.59%和2.29%，且叶片中的黄酮含量高于块根；地黄叶片的毛蕊花糖苷含量分别为7.015 mg/g和0.475 mg/g，说明地黄叶片中毛蕊花糖苷含量高于块根中的含量。

参考文献：

[1]朴仁哲，赵洪颜，金玉姬. 地黄田特用除草剂百草枯的初步研究[J]. 农药，2008，47（4）：288-289，291.

[3]Jae C C，Sang Y M. Physiological response of Rehmannia glutinosa to paraquat and its tolerance mechanisms[J]. Pesticide Biochemistry and Physiology，1997，59：51-63.

[4]武宝开，Mitchell E D，Johnson B L，等. 野生种花生叶片内超氧化物歧化酶及其抗百草枯特性[J]. 植物生理学报，1990，16（2）：147-152.

[5]赵洪颜，林昊，金玉姬，等. 地黄叶片提取物抗氧化活性及其薄层色谱的初步研究[J]. 安徽农业科学，2009，37（4）：1458-1459，1462.

[6]李寒冰，苗静静，李根林，等. 生、熟地黄的体外抗氧化活性测定方法研究[J]. 中国医药指南，2012，10（9）：393-395.

[7]苗明三，孙艳红，方晓艳. （怀）熟地黄多糖抗氧化作用[J]. 中国中医药信息杂志，2002，9（10）：32-33.

[8]魏福香. 除草剂药害试验方法[J]. 杂草科学，1992（3）：18-21.

[9]Liu M J，Li J X，Guo H Z，et al. The effects of verbascoside on plasma lipid peroxidation level and erythrocyte membrane fluidity during immobilization in rabbits：a time course study[J]. Life Sciences，2003，73（7）：883-892.戈林泉，王芳，吴进才. 2种选择性农药的使用对稻纵卷叶螟产卵及生理生化的影响[J]. 江苏农业科学，2014，42（1）：102-105.