杨树MIR156基因家族的进化与功能分化

刘志祥　曾超珍　周永青　谭晓风

摘要：为阐明杨树MIR156基因家族的进化过程和功能分化，研究了杨树MIR156基因家族的扩张模式、倍增时间、系统发育、表达方式、启动子元件和靶基因。结果表明：杨树MIR156基因家族主要通过染色体大片段重复实现扩张，而串联重复对此没有贡献；不同家族成员表达方式已分化，其中ptc-MIR156g/h/i/j表达活性最高；家族成员启动子顺式作用元件存在差异；杨树MIR156的靶基因包括29个SBP结构域蛋白质，由于成熟序列存在差异，家族成员调控的靶基因也表现出差异。说明杨树MIR156基因家族成员的功能已经分化，在杨树中可能形成了复杂的调控网络。

关键词：杨树；microRNA；MIR156基因家族；分子进化；功能分化

中图分类号： Q943文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）01-0026-04

收稿日期：2013-08-13

基金项目：湖南省自然科学基金（编号：13JJ3095）；中南林业科技大学青年基金（编号：QJ2011042B）。

作者简介：刘志祥（1978—），男，湖南湘阴人，博士研究生，讲师，主要从事植物分子遗传学研究。E-mail：liuzx0927@foxmail.com。

通信作者：谭晓风，博士，教授，主要从事林业生物技术研究。Tel：（0731）85623406；E-mail：tanxiaofengcn@126.com。杨树是全球范围内广泛栽培的速生丰产用材树种和生物质能源树种，具有重要经济价值，同时在生态环境保护中也具有重要价值[1]。自毛果杨（Populus trichocarpa）基因组完成测序后[2]，杨树作为一个重要的模式系统广泛用于木材形成、周期性生长、适应性等方面的研究[3]。

植物微RNA（microRNA，miRNA）是一类具有调控作用的非编码小分子RNA。miRNA由基因组编码，通过RNA聚合酶Ⅱ转录，通过DCL等蛋白的剪切加工形成长约21 nt的成熟序列，并在多种蛋白质的参与下识别与其序列互补的靶mRNA并介导其翻译抑制或剪切，从而实现对靶基因的转录后调控。由于miRNA的靶基因往往是具有调控功能的转录因子等，所以miRNA对植物生长发育和胁迫应答具有十分重要的调控功能，在植物分子育种中具有良好的应用前景[4]。

MIR156是一个古老的miRNA基因家族，对植物生长发育具有非常重要的调控作用，如赤霉素途径[5]、育性[6]、发育阶段转变[7-8]、叶原基间隔长度与器官形态[9]等。已有的研究主要以拟南芥（Arabidopsis thaliana）为材料，而MIR156在木本植物中的功能尚未见报道。本研究通过对杨树MIR156基因家族的扩张模式、倍增时间、系统发育、表达方式、启动子元件和靶基因的研究，初步阐明杨树MIR156基因家族的进化过程和功能分化，以期为杨树MIR156基因的功能研究以及在分子育种中的应用奠定基础。

1材料与方法

1.1基因组定位与基因倍增模式分析

从miRBase数据库（www.mirbase.org，Release 19）中获取ptc-MIR156基因家族序列和在杨树基因组JGI_Poptr 2.0中的坐标，以FASTA格式将杨树基因组数据提交给Phytozome数据库（www.phytozome.net），经BLAST比对获取其在杨树基因组JGI_Poptr 3.0上的坐标。采用Maher等的方法[10]对杨树基因组数据（JGI_Poptr 3.0）进行基因家族扩张模式分析，包括串联重复和染色体大片段重复。

1.2基因倍增时间估算

对倍增块中保守的蛋白质编码基因采用Clustal X进行氨基酸序列比对，然后以氨基酸序列比对结果为参照，进行编码序列比对，使用KaKs_Calculator计算序列间同义替换率[Ks（次/个）]；Ks=替换次数/同义替换位点个数，算法选择YN法。求得Ks平均值以用于计算倍增时间，计算公式为：D=Ks/（2E）。式中：D表示时间（年），[次/（个·年）]；E[E=替换次数/（同义替换位点个数×时间）]表示分子替换速率。杨树分子进化速率约为拟南芥的1/6[2]，在拟南芥中 E=1.5×10-8次/（个·年）[11]，所以杨树E取2.5×10-9次/（个·年）。

1.3分子系统发育树构建

将杨树MIR1156基因家族序列进行MUSCLE比对，比对结果输入到MEGA5软件中，分别采用最大似然法和邻接法构建系统进化树，采用自展法检验进化树，重复值设置为 1 000。

1.4启动子顺式作用元件分析

参考Cui等的方法[12]，从Phytozome数据库（http：//www.phytozome.net，JGI_Poptr 3.0）中获取ptc-MIR156基因家族上游启动子序列。将所获取的序列提交给PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/），分析其中的顺式作用元件。

1.5表达分析

从毛果杨小RNA高通量测序结果[13]中提取MIR156基因家族成员原始测序读数，并进行均一化处理计算表达量：表达量=原始读数/与基因组匹配的总读数×106。

1.6靶基因分析

杨树MIR156基因家族靶基因预测采用psRNATarget（http：//plantgrn.noble.org/psRNATarget/#），将miRNA成熟序列提交给psRNATarget，靶基因搜索范围设置为Populus trichocarpa transcript（phytozome v8.0，genome V3.0，internal number 210），参数为默认值。

2结果与分析

2.1基因组定位与基因倍增模式分析

通过查询miRBase和Phytozome数据库获取杨树MIR156基因家族在杨树基因组中的位置信息（表1）。杨树MIR156基因家族共有12个成员，除ptc-MIR156h在JGI_Poptr 3.0中未找到定位，其余11个成员均在JGI_Poptr 3.0找到了位置。从定位情况可知，杨树MIR156基因家族成员在基因组上均为分散分布，未见成簇分布，说明杨树MIR156基因家族成员间没有串联重复关系。表1杨树MIR156基因家族成员的基因组定位情况

MIR156基因家庭成员1基因组定位（JGI_Poptr2.0）1基因组定位（JGI_Poptr3.0）1证据ptc-MIR156h1scaffold_4：7938832-7938934[-]1—1克隆[2，14-15]ptc-MIR156l1scaffold_1：34445840-34445933[-]1Chr01：34292488-34292581[+]1小RNA深度测序[13]ptc-MIR156a1scaffold_6：19089414-19089514[-]1Chr06：20084161-20084261[-]1与ath-MIR156b序列相似[2]ptc-MIR156b1scaffold_6：22869899-22869999[-]1Chr06：23735954-23736054[-]1与ath-MIR156f序列相似[2，15]ptc-MIR156c1scaffold_6：25766668-25766767[+]1Chr06：26631525-26631624[+]1与ath-MIR156a序列相似[2]ptc-MIR156k1scaffold_11：11956115-11956215[-]1Chr11：11382228-11382328[-]1与ath-MIR156a序列相似[2]ptc-MIR156i1scaffold_12：4332062-4332160[-]1Chr12：4939241-4939339[+]1克隆[2，14-15]ptc-MIR156j1scaffold_15：4013699-4013798[+]1Chr15：4227002-4227101[-]1克隆[2，14-15]ptc-MIR156g1scaffold_5：11875533-11875635[-]1Chr17：13418464-13418566[+]1克隆[2，14-15]ptc-MIR156f1scaffold_18：12448484-12448584[-]1Chr18：13566875-13566975[-]1与ath-MIR156b序列相似[2]ptc-MIR156e1scaffold_18：2189691-2189790[+]1Chr18：1583358-1583457[-]1与ptc-MIR156j 序列相似[2，14]ptc-MIR156d1scaffold_18：8350103-8350203[+]1scaffold_28：190974-191074[+]1与ptc-MIR156g序列相似[2，14-15]

通过分析各成员的侧翼保守蛋白质基因，共发现5对基因为染色体大片段重复的产物，对其中侧翼保守蛋白质基因数量大于4的倍增基因对进行了倍增时间估算，结果见表2。表2显示，产生倍增基因对ptc-MIR156a与ptc-MIR156f、ptc-MIR156c 与ptc-MIR156e的染色体大片段重复发生的时间分别约在4 598万、5 605万年前，这一时间与杨树进化过程中最近所经历的一次全基因组重复——杨柳科重复在时间上较接近。表2染色体大片段重复及其时间估算

倍增基因11倍增基因21保守侧翼蛋白质基因对数1平均Ks1Ks标准差1倍增时间（万年）ptc-MIR156a1ptc-MIR156f1910.280 256 44410.096 534 03515 605ptc-MIR156c1ptc-MIR156e1910.229 8821 1110.034 782 32814 598ptc-MIR156i1ptc-MIR156j121—1—1—ptc-MIR156a1ptc-MIR156e111—1—1—ptc-MIR156g1ptc-MIR156l111—1—1—

由此可见，杨树MIR156基因家族主要通过染色体大片段重复实现基因家族的扩张，而串联重复对杨树MIR156基因家族的扩张并没有贡献。

2.2分子系统发育树构建

分别采用邻接法和最大似然法构建杨树MIR156基因家族的分子系统发育树，这2种方法所建进化树结构相似，且大部分节点的Bootstrap值大于70，说明所建分子系统发育树是可靠的，其中邻接树如图1所示。将分子系统发育树与基因倍增模式分析结果进行比较，结果发现，通过染色体大片段重复所产生的重复基因如ptc-MIR156a与ptc-MIR156f、ptc-MIR156c与ptc-MIR156e、ptc-MIR156i与ptc-MIR156j在进化树上位于分支末端，说明这些染色体大片段重复导致的基因家族扩张是杨树MIR156基因家族进化过程中较晚的事件；ptc-MIR156b与ptc-MIR156d、ptc-MIR156g与ptc-MIR156h在进化树中位于分支末端，但它们不是串联重复和染色体大片段重复的产物，说明它们可能是通过转座等其他方式进行扩张的产物[16]。

2.3表达分析

基于小RNA高通量测序的表达分析结果如图2所示。从图2可知，在叶片、木质部、机械胁迫木质部和混合组织（包括营养生长茎尖、雄花、雌花、雌株顶芽、雄株顶芽和侧芽）中，ptc-MIR156g/h/i/j表达活性最高，其次是ptc-MIR156a/b/c/d/e/f，ptc-MIR156k与ptc-MIR156l表达活性均很低，在混合组织中甚至没有检测到。

杨树MIR156基因家族在叶片和木质部中表达活性较高，而在以花和芽组成的混合组织中表达活性较低。另外，杨树MIR156基因家族各成员中的表达水平在不同组织中呈现出多样性，说明不同成员的表达方式已经分化。

2.4启动子顺式作用元件分析

采用PlantCARE分析杨树MIR156家族11个成员上游启动子所含的顺式作用元件，部分元件如表2所示。结果（表3）显示，家族成员上游均具有CAAT-box、TATA-box等基本元件，可能都具有转录活性。同时，在不同成员上游发现了多个与激素调控、胁迫响应及光响应相关的元件，说明MIR156可能参与这些过程的调控。表3还显示，不同成员的上游元件存在差异，而这将导致不同成员的表达存在时空差异。

2.5靶基因分析

将杨树MIR156基因家族的成熟序列进行比对，结果如图3所示，12个家族成员产生的成熟序列只有4种，分别为ptc-MIR156a/b/c/d/e/f、ptc-MIR156g/h/i/j、ptc-MIR156k和ptc-MIR156l。4种成熟序列存在差异，可能导致其识别的靶基因有所差异。

通过psRNATarget预测分析共找到杨树MIR156的靶基因29个，均为SQUAMOSA启动子结合蛋白（SQUAMOSA promoter binding protein，SBP）。SBP是植物特有的一类转录因子，对植物的生长发育具有重要的调控功能，如花与果实发育、赤霉素途径、铜应答过程等[17]。但由于成熟序列存在差异，导致不同成员的靶基因存在一定差异（图4）。其中20个基因是全部成员的预测靶基因，而ptc-MIR156a/b/c/d/e/f和ptc-MIR156k分别独有2个靶基因。这说明由于杨树MIR156基因家族成员间成熟序列的差异，可能导致它们调控的靶基因也已经出现了差异，即不同成员间已出现了功能分化。

3结论

miRNA通过靶基因的反向重复或随机序列而起源，通过染色体片段重复或串联重复实现家族扩张[16，18]。扩张模式分析结果表明，杨树MIR156基因家族主要通过染色体大片段重复实现扩增，而串联重复对此没有贡献。基于miRNA深度测序的表达分析结果表明，杨树MIR156基因家族成员的表达方式已经分化，而且不同成员的上游顺式作用元件及调控的靶基因也表现出差异，说明家族成员间功能已经分化，MIR156基因家族在杨树中可能已经形成了复杂的调控网络，参与不同生命活动的调控。杨树为多年生木本植物，其生长发育与拟南芥等一年生或二年生植物差异显著，所以进一步研究MIR156及其靶基因SBP转录因子对杨树生长发育的调控具有重要意义。

参考文献：

[1]Yang X H，Kalluri U C，DiFazio S P，et al. Poplar genomics：state of the science[J]. Crit Rev Plant Sci，2009，28（5）：285-308.

[2]Tuskan G A，DiFazio S，Jansson S，et al. The genome of black cottonwood，Populus trichocarpa （Torr. & Gray）[J]. Science，2006，313（5793）：1596-1604.

[3]Jansson S，Douglas C J. Populus：a model system for plant biology[J]. Annu Rev Plant Biol，2007，58：435-458.

[4]Chen X M. Small RNAs and their roles in plant development[J]. Annu Rev Cell Dev Biol，2009，25：21-44.

[5]Yu S，Galvo V C，Zhang Y C，et al. Gibberellin regulates the Arabidopsis floral transition through MIR156-targeted SQUAMOSA promoter binding-like transcription factors[J]. Plant Cell，2012，24（8）：3320-3332.

[6]Xing S，Salinas M，Hhmann S，et al.MIR156-targeted and nontargeted SBP-box transcription factors act in concert to secure male fertility in arabidopsis[J]. Plant Cell，2010，22（12）：3935-3950.

[7]Wang J W，Czech B，Weigel D. MIR156-Regulated SPL transcription factors define an endogenous flowering pathway in Arabidopsis thaliana[J]. Cell，2009，138（4）：738-749.

[8]Wu G，Park M Y，Conway S R，et al. The sequential action of MIR156 and MIR172 regulates developmental timing in Arabidopsis[J]. Cell，2009，138（4）：750-759.

[9]Wang J W，Schwab R，Czech B，et al. Dual effects of MIR156-targeted SPL genes and CYP78A5/KLUH on plastochron length and organ size in Arabidopsis thaliana[J]. Plant Cell，2008，20（5）：1231-1243.

[10]Maher C，Stein L，Ware D. Evolution of Arabidopsis microRNA families through duplication events[J]. Genome Res，2006，16（4）：510-519.

[11]Koch M A，Haubold B，Mitchell-Olds T. Comparative evolutionary analysis of chalcone synthase and alcohol dehydrogenase loci in Arabidopsis，Arabis，and related genera （Brassicaceae）[J]. Mol Biol Evol，2000，17（10）：1483-1498.

[12]Cui X，Xu S M，Mu D S，et al. Genomic analysis of rice microRNA promoters and clusters[J]. Gene，2009，431（1/2）：61-66.

[13]Puzey J R，Karger A，Axtell M，et al. Deep annotation of Populus trichocarpa microRNAs from diverse tissue sets[J]. Mol Biol Evol，2000，17 （10）：1483-1498.

[14]Lu S，Sun Y H，Shi R，et al. Novel and mechanical stress-responsive microRNAs in Populus trichocarpa that are absent from Arabidopsis[J]. Plant Cell，2005，17（8）：2186-2203.

[15]Zhang B，Pan X，Cannon C H，et al. Conservation and divergence of plant microRNA genes[J]. Plant J，2006，46（2）：243-259.

[16]Nozawa M，Miura S，Nei M. Origins and evolution of microRNA genes in plant species[J]. Genome Biol Evol，2012，4（3）：230-239.

[17]葛安静，张春华，董清华，等. 草莓SBP基因家族生物信息学初步分析[J]. 中国农学通报，2012，28（13）：215-220.

[18]魏强，梁永宏，李广林. 植物miRNA的进化[J]. 遗传，2013，35（3）：315-323.乔新荣，赵丽平，孙伟，等. 拟南芥PHOT2基因超表达载体的构建及转化[J]. 江苏农业科学，2014，42（1）：30-32.

[10]Maher C，Stein L，Ware D. Evolution of Arabidopsis microRNA families through duplication events[J]. Genome Res，2006，16（4）：510-519.

[11]Koch M A，Haubold B，Mitchell-Olds T. Comparative evolutionary analysis of chalcone synthase and alcohol dehydrogenase loci in Arabidopsis，Arabis，and related genera （Brassicaceae）[J]. Mol Biol Evol，2000，17（10）：1483-1498.

[12]Cui X，Xu S M，Mu D S，et al. Genomic analysis of rice microRNA promoters and clusters[J]. Gene，2009，431（1/2）：61-66.

[13]Puzey J R，Karger A，Axtell M，et al. Deep annotation of Populus trichocarpa microRNAs from diverse tissue sets[J]. Mol Biol Evol，2000，17 （10）：1483-1498.

[14]Lu S，Sun Y H，Shi R，et al. Novel and mechanical stress-responsive microRNAs in Populus trichocarpa that are absent from Arabidopsis[J]. Plant Cell，2005，17（8）：2186-2203.

[15]Zhang B，Pan X，Cannon C H，et al. Conservation and divergence of plant microRNA genes[J]. Plant J，2006，46（2）：243-259.

[16]Nozawa M，Miura S，Nei M. Origins and evolution of microRNA genes in plant species[J]. Genome Biol Evol，2012，4（3）：230-239.

[17]葛安静，张春华，董清华，等. 草莓SBP基因家族生物信息学初步分析[J]. 中国农学通报，2012，28（13）：215-220.

[18]魏强，梁永宏，李广林. 植物miRNA的进化[J]. 遗传，2013，35（3）：315-323.乔新荣，赵丽平，孙伟，等. 拟南芥PHOT2基因超表达载体的构建及转化[J]. 江苏农业科学，2014，42（1）：30-32.

[10]Maher C，Stein L，Ware D. Evolution of Arabidopsis microRNA families through duplication events[J]. Genome Res，2006，16（4）：510-519.

[11]Koch M A，Haubold B，Mitchell-Olds T. Comparative evolutionary analysis of chalcone synthase and alcohol dehydrogenase loci in Arabidopsis，Arabis，and related genera （Brassicaceae）[J]. Mol Biol Evol，2000，17（10）：1483-1498.

[12]Cui X，Xu S M，Mu D S，et al. Genomic analysis of rice microRNA promoters and clusters[J]. Gene，2009，431（1/2）：61-66.

[13]Puzey J R，Karger A，Axtell M，et al. Deep annotation of Populus trichocarpa microRNAs from diverse tissue sets[J]. Mol Biol Evol，2000，17 （10）：1483-1498.

[14]Lu S，Sun Y H，Shi R，et al. Novel and mechanical stress-responsive microRNAs in Populus trichocarpa that are absent from Arabidopsis[J]. Plant Cell，2005，17（8）：2186-2203.

[15]Zhang B，Pan X，Cannon C H，et al. Conservation and divergence of plant microRNA genes[J]. Plant J，2006，46（2）：243-259.

[16]Nozawa M，Miura S，Nei M. Origins and evolution of microRNA genes in plant species[J]. Genome Biol Evol，2012，4（3）：230-239.

[17]葛安静，张春华，董清华，等. 草莓SBP基因家族生物信息学初步分析[J]. 中国农学通报，2012，28（13）：215-220.

[18]魏强，梁永宏，李广林. 植物miRNA的进化[J]. 遗传，2013，35（3）：315-323.乔新荣，赵丽平，孙伟，等. 拟南芥PHOT2基因超表达载体的构建及转化[J]. 江苏农业科学，2014，42（1）：30-32.