黄瓜花叶病毒荧光定量PCR检测方法的建立

孙 洁，王 婉，周 翎，阮小蕾，饶雪琴，李华平

(华南农业大学 资源环境学院，广东 广州510642)

香蕉广泛种植于热带亚热带地区，在进出口贸易中占有很重要的位置．植物病毒病是影响香蕉繁殖和种质资源交流的重要因素，在世界很多香蕉种植区均有报道黄瓜花叶病毒Cucumber mosaic virus(CMV)引起的香蕉花叶心腐病对香蕉生产造成重大损失［1-2］．在黄瓜花叶病毒侵染的叶片上，特别是嫩叶，出现黄绿相间的花叶状条纹或褪绿的梭状斑，叶缘有轻微卷曲［3］．CMV 属于雀麦花叶病毒科Bromoviridae 黄瓜花叶病毒属Cucumovirus，是典型的三分体单链正义RNA 病毒．研究［4-6］发现CMV 外壳蛋白(Coat protein，CP)与病毒粒子组装和蚜虫传播相关;CP 序列的遗传多样性分析表明CMV 主要有2 个亚组．目前对CMV 尚未形成一套安全、高效、稳定的病毒防控技术，因此有必要对此进行研究．

香蕉中CMV 的检测方法主要有ELISA、斑点杂交法、RT-PCR、免疫捕获RT-PCR［7-10］、核酸分子杂交［11］、基因芯片技术［12］及RT-LAMP［13］等，这些方法在检测速度、灵敏度及特异性等方面有一定的局限性．目前，基于PCR、荧光标记和激光技术［14］的定量PCR，灵敏度高、特异性强、重复性好，在植物病毒检测中已得到广泛的运用［15-17］．利用荧光定量方法检测花卉、桃蚜中的CMV 虽有报道［18-19］，但香蕉中CMV 的荧光定量检测方法鲜见报道．本研究根据CMV CP 基因保守序列设计了荧光定量PCR 特异性探针及引物，建立了香蕉中CMV 的荧光定量PCR 检测方法．

1 材料与方法

1．1 样品、仪器与试剂

感染CMV、BSV、BBTV 的香蕉植株采自华南农业大学农场和云南省保山市．

Ex Taq DNA 聚合酶、dNTPs、pMD18-T 载体、质粒纯化试剂盒、PrimeScriptTMRT Master Mix(Perfect Real Time)、Premix Ex TaqTM、实时荧光定量PCR 仪(Thermal Cycler Dice)均购于TaRaKa 公司．大肠埃希菌JM109 由华南农业大学植物病毒室提供．核酸蛋白分析仪(Nanophotometer，产自IMPLEN)．

1．2 试验方法

1．2．1 引物与探针的设计 根据GenBank 上已登录的CMV CP 基因序列(登录号:AY965892．1)设计引物和探针，MF1:5'-CGATAAGAAGCTTGTTTCGCG-3'，CMV-R:5'-CGGCGTACTTTCTCATGTCAC-3'，探针P:5'-ROX-CGTTACCGCCATCTCTGCTATGTTCGCBHQ2-3'，引物和探针均由TaRaKa 公司合成．

1．2．2 模板RNA 的提取及cDNA 的制备 按照王玉成等［20］方法进行RNA 抽提，放于－20℃保存．根据PrimeScriptTMRT Master Mix(Perfect Real Time)说明进行RNA 的反转录以合成cDNA．反应体系:5×Prime-Script RT Master Mix 2 μL，RNA 2 μL，RNase-free ddH2O 6 μL．反应条件为:37 ℃15 min，85 ℃5 s．

1．2．3 质粒标准品的制备 以抽提出的RNA 为模板进行RT-PCR，反应体系为:PrimeScript 1 step Enzyme Mix 1 μL，2×step Buffer 12.5 μL ，MF1、CMVR 各1 μL(10 μmol·L－1)，加RNase-free ddH2O 至25 μL．反应条件为:50 ℃30 min;95 ℃5 min，95 ℃30 s，59 ℃1 min，72 ℃1 min，35 个循环;72 ℃延伸10 min．反应得到目的大小片段后，用切胶回收试剂盒回收PCR 产物．依试剂盒说明说将目的片段连接至pMD18-T 载体，并转化至JM109 感受态细胞中．涂板，挑出白色菌落进行摇菌，用质粒抽提试剂盒抽提质粒，并测序．经鉴定正确的作为阳性质粒，用核酸蛋白仪测定其质量浓度，然后计算拷贝数:

拷贝数=［6.02×1023×ρ］÷［碱基数×660×10－3］．

经计算本试验所得质粒DNA 拷贝数为4.2×1010μL－1，以10 倍梯度稀释，作为绝对定量的标准品．

病毒拷贝数的计算:将未知样品的Ct值代入所得标准曲线中，即可得到未知样品的病毒拷贝数．其中，Ct值是指每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数．

1．2．4 荧光定量PCR 反应条件的优化与标准曲线的制作 以制备的标准品为模板，对实时荧光定量的引物与探针的浓度及退火温度进行优化，确立最佳反应体系．25 μL 反应体系:Real-time 2×Taq 12.5 μL，MF1、CMV-R 各1 μL(10 μmol·L－1)，P(10 μmol·L－1)0.5 μL，模板2 μL，加灭菌的ddH2O 25 μL．最佳反应条件为:95 ℃10 s;95 ℃5 s，59 ℃30 s，72 ℃30 s，40 个循环．以10 倍梯度稀释的标准品为模板，建立25 μL PCR 反应体系，根据优化的反应条件，荧光定量PCR 仪扩增．反应结束后，仪器自动生成标准曲线．

1．2．5 荧光定量PCR 灵敏性、特异性和重复性试验以制备的CMV 标准品按10 倍梯度稀释为模板，进行荧光定量PCR 和普通PCR 试验，根据各模板的Ct值确定检测下限．以4.2×107μL－1为模板，重复7次，进行统计分析，根据变异系数确定该体系的可重复性．以感染BBTV、BSV 的香蕉植株DNA，及CMV的cDNA 为模板，进行荧光定量PCR，进行荧光定量特异性试验．

PCR 体系:Taq 酶0.2 μL，MF1、CMV-R 各1 μL(10 μmol·L－1)，10×Buffer 2.5 μL，dNTPs(2.5 mmol·L－1)2.0 μL，模板1 μL，加灭菌的ddH2O 至25 μL．反应条件:95 ℃5 min;95 ℃30 s，59 ℃1 min，72 ℃1 min，35 个循环;72 ℃延伸10 min．

1．2．6 荧光定量PCR 的实际应用 采集不同香蕉植株叶片抽提的RNA 反转录的cDNA 为模板，进行荧光定量PCR．此外，还抽提了同一感染CMV 的香蕉植株不同部位的RNA，包括只有叶片和含叶脉的叶片，各0.1 g，以确定植株的不同部位的病毒含量是否存在差异．

2 结果与分析

2．1 质粒标准品的制备

以抽提的香蕉RNA 为模板，应用MF1、CMV-R 进行RT-PCR，获得了与目的片段大小一致的扩增产物，经测序比对，与GenBank 中的CMV 序列具有高度相似性，表明已成功构建了CMV 重组质粒标准品．

2．2 标准曲线的构建

以梯度稀释的CMV 质粒DNA 为模板，进行荧光定量PCR，得到CMV 的标准曲线(图1)．标准品模板拷贝数在4.2×102～4.2×107μL－1范围内，与Ct值呈现良好的线性关系(本试验中Ct值＞35 视为阴性)．

图1 荧光定量PCR 检测黄瓜花叶病毒标准曲线Fig．1 Standard curve of the real-time PCR of CMV detection

2．3 荧光定量PCR 的特异性

以感染BBTV 、BSV 的香蕉植株DNA 及CMV 的cDNA 进行荧光定量PCR，除CMV 的cDNA 之外，其他均为阴性，表明该方法具有良好的特异性(图2)．

图2 黄瓜花叶病毒荧光定量PCR 特异性试验Fig．2 Specificity of real-time PCR of CMV detection

2．4 荧光定量PCR 重复性和灵敏性检测

重复扩增试验所得Ct值(17.84～19.06)的变异系数小于1.04%，表明本试验建立的荧光定量PCR 检测方法重复性好．

以梯度稀释的标准品为模板，进行荧光定量PCR 和普通PCR，结果表明，荧光定量PCR 检测标准品的灵敏度为4.2×102μL－1(Ct值为33.37)，普通PCR 检测的灵敏度为4.2×104μL－1(图3a)．对感染CMV 的香蕉叶片进行RNA 抽提，反转录成cDNA 后，进行稀释，分别以稀释后的cDNA 为模板进行荧光定量PCR 和普通PCR，结果表明，荧光定量PCR 检测cDNA 的灵敏度为104(Ct值为33．25)，普通PCR 检测cDNA 的灵敏度为103(图3b)．

图3 黄瓜花叶病毒PCR 电泳图Fig．3 Electrophoresis analysis of CMV by PCR

2．5 荧光定量PCR 的应用

采集田间香蕉样品共14 份，抽提RNA，反转录成cDNA 后进行荧光定量PCR，结果显示，5 份样品与阳性对照一样有明显的扩增曲线，且Ct值为19.85～25.62，其余样品同阴性对照相同，无扩增曲线．

用荧光定量PCR 检测感病香蕉植株不同部位的CMV，结果表明，0.1 g 香蕉叶片中约含有5.14×107个病毒拷贝，0.1 g 叶片与叶脉混合物中约含有1．1×108个病毒拷贝．由试验结果可知相同质量的香蕉组织，叶脉和叶片混合样中CMV 含量高于叶片．

3 讨论

本研究根据CMV 的CP 基因的保守序列设计了荧光定量PCR 的探针及引物，保证了所扩增基因的特异性，且所建立的CMV 荧光定量PCR 检测方法具有重复性和可靠性．然而荧光定量PCR 在检测过程中，相同模板不同重复间Ct值常存在差异，这可能是由于加样时人为误差造成的，或是PCR 仪的边缘效应造成的［21］．王芳等［22］建立的烟草CMV 的SYBR荧光定量检测法，未对其重复性、灵敏度及特异性进行探讨．有研究［23］表明，TaqMan 探针法比SYBR 染料法特异性更强，灵敏度更高．

在灵敏度比较试验中，笔者分别以CMV 质粒DNA 及cDNA 为模板进行荧光定量PCR 与普通PCR，以质粒DNA 为模板时，荧光定量PCR 灵敏度是普通PCR 的100 倍，而以cDNA 为模板时，其灵敏度是普通PCR 的10 倍．不同模板间灵敏度的差异可能是由于质粒DNA 经过处理后纯度较cDNA 高，而cDNA 中所含的反转录酶、酚等可能影响了PCR 扩增的原因［24-25］．在同一香蕉植株中，叶脉与叶片混合物中CMV 病毒含量高于叶片，可能与CMV 在香蕉中的运输特性相关［26］，这将为田间香蕉样品的采样提供一定的依据．

本研究建立的TaqMan 荧光定量PCR 检测方法，可检测香蕉中CMV 并可对其进行绝对定量，也可用于研究CMV 在植株体内的运动、抗病种质资源的筛选、寄主－病毒－介体间相互作用等．

［1］HOOKS C R R，WRIGHT M G，KABASAWA D S，et al．Effect of banana bunchy top virus infection on morphology and growth characteristics of banana［J］．Ann Appl Biol，2008，153(1):1-9．

［2］JERIDI M，ESCOUTE J，FONDI E，et al．Homoeologous chromosome pairing between the A and B genomes of Musa spp．revealed by genomic in situ hybridization［J］．Ann Bot，2011，108(5):975-981．

［3］AYO-JOHN E I，EKPO E J A，ODEDARA O O，et al．Virus symptom expressions on Musa landraces in 1999，2000 and 2004 in Southern Nigeria:Cucumber mosaic virus(CMV)disease incidence and subgroup differentiation［J］．Arch Phytopathol Plant Protect，2011，44(6):547-557．

［4］JACQUEMOND M．Cucumber mosaic virus:Vol．84［M］．Montfavet:Adv Virus Res，2012:439-504．

［5］ROOSSINCK M J．Cucumber mosaic virus，a model for RNA virus evolution［J］．Mol Plant Pathol，2001，2(2):59-63．

［6］王达新，郭刚，殷晓敏，等．黄瓜花叶病毒研究进展［J］．现代农业科技，2013(3):121-123．

［7］黄孟群，廖志松．检测香蕉花叶心腐病病原CMV 的PAS-ELISA 方法的改进［J］．生物工程学报，1996，12(3):335-339．

［8］HU Jinsheng，LI Huaping，BARRYK，et al．Comparison of dot blot，ELISA，and RT-PCR assays for detection of two Cucumber mosaic virus isolates infecting banana in Hawaii［J］．Plant Dis，1995，79(9):902-906．

［9］刘志昕，潘俊松，郑学勤．香蕉花叶心腐病的血清学诊断及检测方法的建立［J］．热带作物学报，1994(S1):19-26．

［10］金羽，文景芝．植物病毒检测方法研究进展［J］．黑龙江农业科学，2005(3):37-40．

［11］覃佐东，徐燕慧，李峰，等．核酸分子杂交检测黄瓜花叶病毒［J］．湖南文理学院学报:自然科学版，2007，19(1):69-71．

［12］贾慧，王艳辉，王进忠，等．基因芯片技术检测黄瓜花叶病毒、烟草花叶病毒和马铃薯Y 病毒［J］．华北农学报，2011，26(1):83-86．

［13］PENG Jun，SHI Minjing，XIA Zihao，et al．Detection of Cucumber mosaic virus isolates from banana by one-step reverse transcription loop-mediated isothermal amplification［J］．Arch Virol，2012，157(11):2213-2217．

［14］伊鋆，蔡雪凤．TaqMan 荧光探针技术在食源性致病菌检测中的应用［J］．食品工业科技，2013(7):374-377．

［15］ABRAHAMIAN P E，JAWDAH Y．Detection and quantitation of the new world Squash leaf curl virus by TaqMan realtime PCR［J］．J Virol Methods，2013，191(1):76-81．

［16］WANG Yawen，LI Yiping，YANG Cuiling，et al．Development and application of a universal TaqMan real-time PCR for quantitation of duck hepatitis B virus DNA［J］．J Virol Methods，2013，191(1):41-47．

［17］WACHARAPLUESADEE S，TEPSUMETHANON，SUPAVONWONG P，et al．Detection of rabies viral RNA by TaqMan real-time RT-PCR using non-neural specimens from dogs infected with rabies virus［J］．J Virol Methods，2012，184(1/2):109-112．

［18］WEI T，LEBAS B S M，SHILLER J B，et al．Detection of five viruses infecting dormant bulbs by TaqMan-based realtime RT-PCR［J］．Australasian Plant Pathol，2012，41(1):93-98．

［19］WANG Fenglong，YANG Jinguang，ZHAI Xilun，et al．A real-time reverse transcription PCR assay for detection of Cucumber mosaic virus in individual peach aphid(Myzus persicae)［J］．ICIEA，2011(3):2624-2627．

［20］王玉成，张国栋，姜静．一种适用范围广的总RNA 提取方法［J］．植物研究，2006，26(1):85-88．

［21］郑卫东，袁仕伟．荧光定量PCR 仪的边缘效应与实验误差分析［J］．医疗卫生装备，2013(2):113-115．

［22］王芳，高正良，周本国，等．利用Real-time RT-PCR 法检测抗病毒活性物质对CMV 复制的影响［J］．烟草科技，2011(1):70-73．

［23］袁亚男，刘文忠．实时荧光定量PCR 技术的类型、特点与应用［J］．中国畜牧兽医，2008，35(3):27-30．

［24］SCHEFE J H，LEHMANN K E，BUSCHMANN I R，et al．Quantitative real-time RT-PCR data analysis:Current concepts and the novel“gene expression's CTdifference”formula［J］．J Mol Med，2006，84(11):901-910．

［25］WINTZINGERODE F，GOBEL U B，STACKEBRANDT E．Determination of microbial diversity in environmental samples:Pitfalls of PCR-based rRNA analysis［J］．FEMS Microbiol Rev，1997，21(3):213-229．

［26］MORENO I M，THOMPSON J R，GARCIA-ARENAL F．Analysis of the systemic colonization of cucumber plants by Cucumber green mottle mosaic virus［J］．J Gen Virol，2004，85(Pt3):749-759．