一株西沙群岛野生诺尼种子的内生细菌CICC 10594 的分离与鉴定

曹艳花，刘 洋，翟 磊，张明娟，谭望桥，程 池

(1. 中国食品发酵工业研究院 中国工业微生物菌种保藏管理中心，北京100015;2. 海南诺尼生物工程开发有限公司，海南 海口570125)

诺尼(Morinda citrifolia L.)，也被称为海巴戟、椿根、桔叶巴戟天、诺丽等，是一种生长于热带、亚热带的茜草科植物. 早期的波利尼西亚人将诺尼带到夏威夷，此后，夏威夷人将其作为最常用的药材［1］. 诺尼富含160 余种营养成分，具有非常独特的保健功效与药用价值［2］，由于诺尼及其相关提取物在抗肿瘤、改善免疫调节功能、减少肝损伤等方面有积极的作用，因此以其为原料的保健食品已被人们用来辅助治疗多种疾病［3］.

植物内生菌概念是由DeBary 首先提出的，它是指在植物生活史的一定阶段存在于活体植物组织内，又不引起植物明显病害的微生物［4］，其中不乏能够促进植物生长的有益微生物种类［5－6］. 本研究以西沙群岛野生诺尼种子中分离和筛选得到的内生细菌菌株CICC 10594 为研究对象，对其进行了多相分类鉴定与分析，旨在为进一步了解其生物功能及其相关机制奠定基础.

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株 供试菌株为野生诺尼种子(采集自中国海南省三沙市永兴岛，具体位置为北纬16.83°，东经112.34°)中分离获得的菌株，目前于中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)保藏，菌株保藏编号为CICC 10594.

1.1.2 培养基 LB 培养基(蛋白胨10.0 g，酵母粉5.0 g，NaCl 10.0 g，琼脂15.0 g，蒸馏水1.0 L，pH7.0).

1.1.3 主要试剂 细菌基因组DNA 提取试剂盒、dNTPs、Taq DNA 聚合酶及DNA Marker 等购自天根生化科技有限公司;API 50 CHB 和API 20E 检验试剂条购自梅里埃公司;其他化学试剂均为进口分析纯产品.

1.2 方 法

1.2.1 菌株分离、纯化与保藏 采用稀释平板涂布法对诺尼种子的内生细菌进行分离筛选. 称取10 g野生诺尼种子，采用乙醇－次氯酸钠联合灭菌［3］的方式对其进行表面灭菌. 在无菌超净工作台中将表面已彻底灭菌的野生诺尼种子充分研磨，置于装有90 mL 无菌ddH2O 的三角瓶中，充分振荡20 ～30 min 后静置5 ～10 min. 梯度稀释以已制备的10－6到10－2倍系列稀释液涂布LB 平板，并置于28 ℃培养箱中培养48 h. 待单菌落出现后，以划线法转接至LB 斜面，并于4 ℃保藏. 同时将所分离的菌株保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心(China Center of Industrial Culture Collection，CICC).

1.2.2 形态学观察 将供试菌株接种于LB 固体培养基中，置于28 ℃培养48 h 后，观察其在LB 培养基上的培养特征;并利用光学显微镜及电子显微镜观察菌体的形态特征［8］.

1.2.3 16S rRNA 序列系统发育分析 采用试剂盒法提取CICC 10594 菌株的基因组DNA(具体方法参见Tiangen 细菌基因组DNA 提取试剂盒的说明书)，提取获得的基因组DNA 用w=1.0%的琼脂糖凝胶进行检测.

以所获得的CICC 10594 菌株基因组DNA 作为模板，以27F 和1492R 为引物扩增细菌16S rRNA，正向引物27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')，反向引物1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')［7］.50 μL PCR 反应体系:50 ng DNA 模板，1 ×Taq Reaction Buffer，引物各20 pmol，20 μmol dNTP，1.5 单位Taq 酶(Ferments). 反应程序为:94 ℃预变性5 min，94 ℃变性1 min，52 ℃复性1 min，72 ℃延伸1 min，30个循环后72 ℃延伸10 min. 采用w=1.0%的琼脂糖凝胶对PCR 扩增产物进行检测，并通过ABI 3700 基因测序仪测序. 将测序结果与EzBioCloud 数据库进行比对并进行近缘种序列相似度计算［8］，同时采用CLUSTAL W 和MEGA 5.0 软件对CICC 10594 进行近缘种多序列比对分析及系统发育分析［9－10］.

1.2.4 生理生化特征鉴定 采用API 20E 及API 50CH 试剂条对菌株CICC 10594 的酶活性、碳源利用等生理生化特征进行检测，具体操作方法按API 试剂条说明书进行.

2 结 果

2.1 形态学观察 菌株CICC 10594 在LB 培养基上培养48 h 后，菌落直径为2 ～4 mm，呈白色、圆形、凸起、湿润、表面光滑、不透明、边缘整齐(见图1a);利用光学显微镜观察，结果显示菌体呈短杆状，单个排列，大小为0.4μm ×0.5μm －0.4μm ×0.8μm，革兰氏阴性(见图1b);菌体电子显微镜成像效果见图1c和1d.

图1 菌株CICC 10594 的形态学观察结果

2.2 16S rRNA 序列系统发育分析 所提取的菌株CICC 10594 的基因组DNA 片段约为23 kb(见图2)，其16S rRNA 基因PCR 产物的大小约为1 500 bp(见图3). 待扩增产物经测序及分析处理后，将其序列信息提交至GenBank，登录号为KJ562861. 以大肠杆菌(Escherichia coli)KCTC 2441T(EU014689)为外群，构建CICC 10594 与相关近缘模式菌株的系统发育树(见图4). 系统发育分析显示，菌株CICC 10594 归属为肠杆菌属(Enterobacter sp.).

图2 CICC 10594 基因组DNA

图3 CICC 10594 16S rRNA 基因扩增产物

图4 邻接法构建的CICC 10594 16S rRNA 基因系统发育树

2.3 生理生化特征鉴定 经API 20E 及API 50CH 试剂条对菌株CICC 10594 的酶活性、碳源利用等生理生化特征进行检测，结果显示:CICC 10594 能够利用柠檬酸盐;具有β-半乳糖苷酶活性;并能够利用葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露醇、肌醇、鼠李糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、蜜二糖、阿拉伯醇等多种碳源物质;鸟氨酸脱羧酶试验(+)，精氨酸双水解酶试验(+)，赖氨酸脱羧酶试验(－)，吲哚(－)，具体结果详见表1. 根据生理生化特征鉴定的结果，对照《伯杰氏系统细菌学手册》(第9 版)中标准菌株的生理生化特征，并同API 数据库信息进行比对，与阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)的相似性为99.9%，表明菌株CICC 10594为阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae).

表1 CICC 10594 的生理生化特征

2.4 菌株CICC 10594 分类鉴定结论 本研究根据微生物代谢类型的差异，通过形态学观察并结合16S rRNA 基因序列系统发育分析，采用生理生化分析方法，检测了微生物对各种基质的代谢作用及其代谢产物，从而鉴定和评价了待检微生物的分类学地位;同时，结合菌体形态和菌落形态特征的观察结果以及生理生化试验的分析结果，并参考相关的文献报道，鉴定西沙群岛野生诺尼种子的内生细菌菌株CICC 10594 为阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae).

3 讨 论

本文采用多相分类鉴定技术对中国西沙群岛野生诺尼种子的内生细菌菌株(CICC 10594)进行了“种”水平的分类鉴定，在鉴定中综合利用了微生物表型、基因型和系统发育分析等多种不同指标信息，从而实现了对微生物的精确分类［11］，这种方法也已广泛应用于微生物分类学领域.

本研究利用细菌通用引物27F 和1492R 对菌株CICC 10594 的16S rRNA 基因进行了扩增与测序，并通过GenBank 数据库及MEGA 5.0 软件进行序列比对和系统发育学的分析，得出CICC 10594 为肠杆菌属(Enterobacter sp.). 经API 20E 及API 50CH 试剂条对菌株CICC 10594 的酶活性、碳源利用等生理生化特征进行检测，结果显示:鸟氨酸脱羧酶试验(+)，精氨酸双水解酶试验(+)，赖氨酸脱羧酶试验(－)，吲哚(－)，同时，CICC 10594 能够利用葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露醇、肌醇、鼠李糖、麦芽糖、蔗糖、蜜二糖、阿拉伯醇等多种碳源物质，符合阴沟肠杆菌的生理生化特征，与API 数据库信息进行比对，它与阴沟肠杆菌的相似性为99.9%，故API 鉴定其为阴沟肠杆菌. 综上，通过16S rRNA 基因系统发育分析，结合菌体形态及菌落形态特征，参照《伯杰氏系统细菌学手册》(第9 版)生理生化特征及API 鉴定结果分析，确定CICC 10594 为阴沟肠杆菌.

2005 年，Hoffmann［12］等确定阴沟肠杆菌包含2 个亚种，分别为阴沟肠杆菌阴沟亚种(Enterobacter cloacae subsp. cloacae)和阴沟肠杆菌溶亚种(Enterobacter cloacae subsp. dissolvens). 肠杆菌属菌株为多种植物的内生优势菌. 杨海莲等［13］分离获得的水稻内生细菌MR12 经鉴定为阴沟肠杆菌，其研究发现，阴沟肠杆菌MR12 作为水稻的内生细菌，不仅具有固氮活性，而且具有防止水稻病害的能力. 本研究首次自诺尼植物中发现并分离得到了CICC 10594，并证明其为阴沟肠杆菌，但对于此菌株的固氮活性及其他功能还有待于进一步的研究. 此外，鉴于该菌为分离自野生诺尼种子的内生细菌群落中的优势菌，因此，它可能在诺尼植物的生长发育及功效性成分的产生方面发挥一定的作用，但是否如此，尚有待进一步的研究.本研究利用微生物多相分类鉴定技术对其分类地位进行了全面的和准确的鉴定，这为今后开展其生物学功能的相关研究奠定了基础. 同时，本研究还发现，CICC 10594 能够利用柠檬酸盐，并具有β －半乳糖苷酶的活性;除此之外，它还能够利用葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露醇、肌醇、鼠李糖、麦芽糖、蔗糖、蜜二糖、阿拉伯醇等多种碳源物质，这为今后充分利用该菌的生物活性和代谢产物，实现其产业利用价值奠定了基础.

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