鸡卵巢中ANXA2基因表达调控研究

朱桂玉

泰山学院生物与酿酒工程学院,山东泰安271021

鸡卵巢中ANXA2基因表达调控研究

朱桂玉

泰山学院生物与酿酒工程学院,山东泰安271021

ANXA2基因属于膜联蛋白家族一员，N-末端区域包含调控PKC通路中酪氨酸和色氨酸两种蛋白激酶磷酸化的位点，曾有研究发现ANXA2基因在高产蛋鸡卵巢中出现了显著性高表达。因此，本实验利用荧光定量PCR方法，研究了ANXA2基因在鸡卵巢和各等级卵泡中的表达规律，发现此基因在开产鸡卵巢中表达升高，并随卵泡发育表达上调，排卵后表达量出现显著性下降。通过分离培养鸡卵泡的膜细胞，添加促卵泡生长素（FSH）和促黄体素（LH）处理，提取细胞RNA和利用荧光定量PCR方法，发现此基因的表达升高与FSH的调控有关，却与LH无关。此作用的具体分子机制，还待于今后进一步的研究。

荧光定量PCR;膜联蛋白Ⅱ;鸡;卵巢

膜联蛋白(ANXA)是一类依赖Ca2+的磷脂结合蛋白家族，现已在人类基因组中发现了13个膜联蛋白亚家族成员。膜联蛋白羧基端结构域含有Ca2+结合位点和磷酸化位点，其中磷酸化位点区域保守，而钙结合位点在不同膜联蛋白中差异较大[1]。

细胞内Ca2+浓度升高时，膜联蛋白可溶性的单体会在胞质中形成三聚体，在膜界面上集合成更有序的结构。Ca2+是胞内主要的第二信使之一，在动物繁殖过程中对精子获能、顶体反应、卵母细胞成熟、受精及卵裂等一系列复杂的过程有非常重要的影响[2]。所以，在哺乳动物中，膜联蛋白除了参与囊泡运输、促进膜融合、调控炎症反应及细胞分化等重要生物功能外，其在生殖方面的作用也已引起了人们的重视。

小鼠中，ANXA1可通过抑制磷脂酶A2的活性来影响精子的顶体反应、精卵融合等过程[3]。另外，制备的小鼠ANXA1多抗可使其体外受精率下降[4]。羊中，其顶体可能是ANXA1的储备库，此基因参与了羊精子与卵母细胞膜的融合启动[5]。人中，ANXA4基因在卵巢癌中存在着异常表达[6]。

前期，本实验室通过高通量Illusion/Solexa测序，以未开产的（6周龄）白来航鸡卵巢为对照组，在开产的（23周龄）鸡卵巢中筛选到了大量差异表达基因，其中包括ANXA2基因。另外，前期我们研究发现ANXA2基因在高产蛋鸡卵巢中出现了显著性高表达。因此，本实验着重研究了ANXA2基因在鸡卵巢发育中的表达规律以及促性腺激素对其表达调控作用，以期为鸡产蛋性能的改良提供理论支持。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物未开产（6周龄）及开产（23周龄，规律产蛋2周以上）白来航鸡各20只，宰杀后取整个卵巢和各级卵泡，迅速投入液氮，-70℃保存，用于RNA的提取及荧光定量PCR的表达分析等实验。

1.1.2 主要试剂RNA提取试剂盒(Qiangen,USA)、SYBR Premix Ex Taq定量试剂盒(TaKaRa,Japan)、逆转录试剂盒(Roche,USA)、M199(Gibco,USA)、FSH与LH(Sigma,USA)。

1.2 引物的设计与合成

根据GenBank上鸡ANXA2基因的mRNA序列(NM_205351.1)和持家基因GAPDH的mRNA序列(NM_204305.1)，在各自的跨外显子区设计特异的荧光定量PCR引物，二对引物均由上海生物工程有限公司合成，引物序列见表1

表1 ANXA2和GAPDH基因的引物序列Table 1 Primers sequences of ANXA2 and GAPDH genes

1.3 RNA的提取与定量

根据Qiagen公司的RNA提取试剂盒说明，分别提取卵巢组织、各等级卵泡、等级卵泡（F2-F4）的颗粒细胞、膜细胞及促性腺激素（FSH和LH）处理前后膜细胞的RNA，用紫外分光光度计测定总RNA浓度及纯度，A260/A280=1.8～2.0时，所得RNA-70℃保存，将所提取总RNA进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，可见所提取总RNA效果较好。

1.4 cDNA合成

根据Roche反转录试剂盒的说明，取1μg总RNA，以Oligo-dT18为引物，完成反转录反应，最后反转录产物于-20℃保存。

1.5 实时荧光定量PCR(real–time PCR)

在Stratagene Mx3000P荧光定量PCR仪上进行荧光定量PCR分析，反应利用Takara的荧光定量PCR试剂盒进行，15µL体系包括cDNA2µL，引物0.1µL，Rox0.3µL，反应程序为95℃10 min；95℃30 s，56℃30 s，72℃30 s；72℃读板，40个循环。构建标准曲线，验证所有引物的扩增效率，目的基因跟持家基因扩增效率均要达到90%～100%之间，检看它们是否具有线性扩增的关系。以GAPDH为内参，至少做6个重复，最后用2-△△CT的方法计算基因的表达相对量。

1.6 颗粒细胞、膜细胞的分离培养与激素处理

取产蛋高峰期母鸡，处死后剖开腹腔，取下整个卵巢，放进盛有青链霉素的PBS液的灭菌烧杯中。根据Gilbert文献[7]介绍方法，分别剥离排卵前等级卵泡（F2-F4）的颗粒细胞层和膜细胞层，剪碎后，分别加入0.1%Ⅱ型胶原酶，放入37℃CO2培养箱中进行消化。其中，颗粒细胞消化时间为6 min左右，膜细胞消化时间为20 min左右。然后，用200目铜网过滤离心，收集细胞沉淀，分别提取颗粒细胞和膜细胞的RNA，用于ANXA2基因定量表达分析。一部分膜细胞，按2×106密度接种于24孔培养板中，38℃静置培养，CO2浓度5%，然后分别添加5 ng/mL、10 ng/mL、50 ng/mL的FSH与LH进行处理24 h，然后倒掉培养基，用PBS冲洗后裂解提取细胞中的RNA。

1.7 数据分析

利用SPSS13.0软件进行统计分析，各组数据用平均数和标准误表示，不同组之间利用单因素方差ANOVA和邓肯式检验进行，P＜0.05为差异显著。

2 结果

2.1 提取RNA的质量鉴定

如图1所示，总RNA的凝胶电泳结果显示清晰的28S与18S条带，说明RNA完整无降解。

图1 总RNA电泳结果Fig.1 Gel electrophoresis of total RNA

2.2 ANXA2基因在鸡不同发育阶段卵巢组织中的表达

从图2可以看出，ANXA2基因在未开产鸡卵巢（6周龄）中表达较低，而在鸡开产卵巢（23周龄）中出现了显著性高表达（P＜0.05）。

2.3 ANXA2基因在鸡开产卵巢各级卵泡中的表达

如图3所示，ANXA2基因表达在小白卵泡（small-white follicle,SWF）中的表达较低，随着卵泡发育成熟，其表达量在F1（the first-largest follicle）卵泡中出现了极显著性增高，而排卵后卵泡（the first post-ovalutory follicle,POF1）表达量出现了显著性下调（P＜0.05）。

图2 ANXA2基因在不同发育阶段鸡卵巢组织中的表达，字母不同者表示差异显著(P＜0.05),以下同Fig.2 The levels of ANXA2 gene expression in diff erent developmental stages of chicken ovary.Bars with different superscript letters are significantly d ifferent(P＜0.05),the same as below

图3 ANXA2基因在鸡卵巢不同等级卵泡中的表达Fig.3 The levels of ANXA2 gene expression in different developmental follicles of chicken ovary

2.4ANXA2基因在卵泡颗粒细胞和膜细胞中的表达

分离培养排卵前等级卵泡（F2-F4）中的颗粒细胞和膜细胞，如图4所示，研究发现ANXA2基因在等级卵泡中的膜细胞出现了显著性高表达，而在颗粒细胞中表达较低。

2.5 FSH和LH对ANXA2基因表达调控的作用

分离培养排卵前等级卵泡（F2-F4）的膜细胞，添加高、中、低三种不同浓度(ng/mL)的FSH和LH进行处理，24 h后，收集细胞，通过荧光定量PCR发现三种浓度的FSH均能上调ANXA2基因的表达，用10 ng/mL的FSH处理后，出现了显著性表达升高。与此相反，低和中等浓度的LH处理后，ANXA2基因的表达却出现了显著性下调，如图5所示。

图4 ANXA2基因在卵泡颗粒细胞和膜细胞中的表达(A)颗粒细胞;(B)膜细胞;(C)ANXA2基因在膜细胞和颗粒细胞中的表达(放大倍数:200x)Fig.4 The level of of ANXA2 gene expression in the granulosa cells and theca cells (A)The granulosa cells;(B)The theca cells;(C)The expression ofANXA2 mRNA in the theca and granulose cells(The number of magnification:200x)

图5 不同浓度的FSH和LH对ANXA2基因表达的影响Fig.5 Effects of different concentrations of FSH and LH on ANXA2 expression in theca cells

3 讨论与结论

卵巢是雌性动物的重要生殖器官，卵巢的功能是产生卵以及类固醇激素。卵泡是卵巢结构和功能的基本单位，卵泡发育是一个伴随着颗粒细胞增殖分化，内膜细胞出现及卵母细胞成熟的过程。这个过程中各种因子和细胞相互作用，协同增殖和分化，间接或直接参与调节卵泡发生和发育直至排卵[8]。在畜牧业生产中，研究禽类卵巢以及卵泡发育调控机制对于提高家禽的繁殖性能，改善蛋禽的产蛋性能，提高生产效率具有重要意义[9]。

禽类卵巢与哺乳动物存在很大差别，成熟的禽类卵巢外观象一串葡萄，含有发育不同阶段的许多卵泡。性成熟后，排卵周期中的卵巢体积非常大，卵巢皮质常含有4～6个伸向腹腔的体积依次递减的最大直径可达40 mm的等级卵泡（分别用F1、F2、F3…表示）和无数等级前小白卵泡（the small-white follicle,SWF），以及排卵后卵泡(the post-ovulatory follicle,POF)等卵泡组成[10]。在鸡的产蛋期，为了维持每天的排卵进程，在一个产蛋序列中必须每天有一个卵泡从等级前卵泡池中被募集出来，进入排卵前的快速发育阶段，直至发育成熟排卵。因此，鸟类成熟卵泡可能是高等脊椎动物中生长最快的结构，小卵泡在几天内可增长150～200倍[11]。本研究发现，在鸡中，随卵巢和卵泡的发育成熟，ANXA2基因出现了显著性上调表达，而排卵后其表达出现了显著性的下调。在猪和大鼠中，Cui等[12]研究发现此基因也随卵母细胞成熟和早期胚胎发育进行了高表达，尤其是在减数分裂的生发泡期。Yang等曾以蛋鸡和肉鸡的母系鸡卵巢为高产蛋率鸡和低产蛋率鸡模型，分别建立了两个相应的CDNA文库。最后，在高产蛋率鸡卵巢中共筛选出了4个高表达的基因，其中就包括ANXA2基因[13]。有研究表明，ANXA2基因的羧基核心区包括Ca2+和F-肌动蛋白等重要因子的结合位点[14]，而卵母细胞的成熟尤其是第二次减数分裂的启动恢复都需要Ca2+的参与。另据研究表明，ANXA2基因主要参与了细胞的胞吐、膜蛋白转运、纤维蛋白溶解以及血管的形成等生理过程[15]。在鸡中，从小白卵泡发育到最大卵泡，卵泡组织需要发生较大的动态变更，此过程要求细胞外基质发生不断的降解、重建和大量供应营养的新血管生成。因此，我们推测随鸡卵泡成熟发育表达上调的ANXA2基因，有可能在促进卵泡血管发育、激发卵母细胞成熟和卵泡细胞增殖等过程中起了重要作用。禽类排卵后的卵泡不形成真正的黄体，而是发生快速的吸收退化，这种退化对于下个卵子的排出及连续性产卵却是必须的[16]。因此，我们推测ANXA2基因在排卵后卵泡表达显著性下调可能与卵泡的这种退化吸收过程中不再需要大量胞外基质的新建与新血管形成有关。

既然，ANXA2基因表达随着卵泡发育成熟出现了显著性升高，那么问题是究竟哪种因子上调了ANXA2基因的表达呢？众所周知，FSH和LH是两种调控卵巢发育的促性腺激素。雌禽中，FSH主要促进卵巢内卵泡的生长和发育，增加卵泡壁摄氧量，促进沉积卵黄物质，增加卵泡的重量和体积。研究发现，在鸡产蛋期若注射FSH则可继续促进卵泡的生长。产蛋率低下的母鸡，注射FSH可增加小黄卵泡和大白卵泡的数量，减少闭锁的小黄卵泡和大白卵泡的数量[17]。而LH主要作用是促进卵泡成熟和排卵，刺激孕酮的分泌。LH能够诱导成熟卵泡颗粒细胞和膜细胞中cAMP的升高，刺激类固醇激素的合成。卵泡发育至12～15 mm时，颗粒细胞开始呈现对LH刺激的反应，而逐渐失去对FSH刺激的反应[18,19]。本实验通过分离培养等级卵泡（F2-F4）膜细胞进行FSH和LH处理，结果发现适当浓度的FSH能够显著性刺激ANXA2基因上调表达，而LH却对它的表达起了抑制作用。FSH和LH在鸡卵巢中的精确而复杂的调控机制，使卵泡能正常发育而排卵，本试验结果表明FSH和LH有可能利用了膜细胞中的不同的信号通路，激活了不同的转录因子，最终协同作用于ANXA2基因的转录激活与抑制。FSH和LH的受体FSHR和LHR都属于G蛋白偶联受体，其在膜细胞中的特异结合蛋白有可能传导不同的信号来激活特异的转录因子[20]。今后，我们还将进一步分析ANXA2的启动子序列中的顺式作用元件，深入分析FSH和LH是如何达到相反的转录调控的。

综上所述，本实验主要研究了ANXA2基因在鸡卵巢成熟和卵泡发育中的表达规律，由于禽类卵巢和卵泡发育又受到自分泌－旁分泌的精准调节，本实验表明卵泡膜细胞中ANXA2基因的上调受到了FSH的促进。总之，通过以上研究，我们希望能为更系统、全面的揭示家禽卵泡发育的分子调控机制，为筛选出有价值的DNA标记及改善鸡的繁殖性能和提高的持续产蛋能力等提供一定的理论基础。

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The Expression and Regulation of ANXA2 Gene in the Chicken Ovary

ZHU Gui-yu
Department of Biology Science and Technology,Taishan University,Tai-an 271021,China

ANXA2 is a family member of the membrane-bound proteins.The N-terminal region contains the tyrosine and threonine phosphorylation sites for protein kinase activation in PKC pathway regulations.Previous studies showed that ANXA2 gene is overexpressed in hens with high ovulation efficiency.This paper has studied the expression patters of ANXA2 gene during the chicken ovary and follicles development by the real-time PCR.The results showed that the expression of ANXA2 increased with the chicken ovary maturation.In hierarchy follicles,ANXA2 mRNA increased significantly as follicular development proceeds in pre-ovulatory follicles,reached the peak expression at the time of ovulation then decreased significantly after ovulation.Then,the theca cells of pre-ovulatory follicles were isolated,and treated with different concentrations of FSH or LH.We found that the theca cell ANXA2 expression was stimulated by FSH but not LH.The molecular mechanism of theANXA2 regulation in chicken ovary should be studied further.

Real-time PCR;ANXA2;chicken;ovary

S831.2

A

1000-2324(2014)03-0347-05

2013-03-12

2013-04-05

山东省自然科学基金(ZR2013CQ002)

朱桂玉(1976-),女,讲师,主要从事动物繁殖育种工作.E-mail:zgy0706@163.com