2型糖尿病大鼠脑组织EGFL-7的表达及氨基胍和Baicalein对其干预作用

王 琼 李惠勉

2型糖尿病大鼠脑组织EGFL-7的表达及氨基胍和Baicalein对其干预作用

王 琼 李惠勉△

目的 研究人表皮生长因子样结构域蛋白-7（EGFL-7）因子在2型糖尿病大鼠脑组织中的表达以及氨基胍、Baicalein干预后对其影响。方法48只SD大鼠随机分为正常对照组、糖尿病组、氨基胍组、Baicalein组4组，每组12只。正常对照组给予普通饮食喂养；糖尿病组、氨基胍组、Baicalein组采用高脂高糖饮食联合腹腔注射小剂量链脲佐菌素的方法建立糖尿病大鼠模型。造模成功后，氨基胍组、Baicalein组分别给予氨基胍溶液、Baicalein溶液灌胃，剂量均为150 mg/（kg·d），正常对照组、糖尿病组给予等量生理盐水灌胃。16周后，用免疫组织化学法及蛋白免疫印迹法（Western blotting）检测各组大鼠脑组织EGFL-7的表达。结果免疫组织化学法及蛋白免疫印迹法均显示，与正常对照组比较，糖尿病组、氨基胍组及Baicalein组EGFL-7的表达均明显增加（P＜0.01），与糖尿病组比较，氨基胍组、Baicalein组EGFL7表达明显降低（P＜0.01），Baicalein组与氨基胍组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。结论EGFL-7可能参与糖尿病大鼠脑血管增生与重塑，氨基胍、Baicalein在一定程度上抑制其血管增生，其抑制作用可能是通过降低EGFL-7表达来实现的。

糖尿病,2型；人表皮生长因子样结构域蛋白-7；氨基胍；Baicalein；血管增生；血管重塑

人表皮生长因子样结构域蛋白-7（epidermal growth factor-like domain-7，EGFL-7）是最新发现的内皮细胞特异性分泌因子，在血管管腔形成中具有重要的作用。近年来发现EGFL-7在斑马鱼[1]、鼠[2]及人[3]的胚胎及动脉血管内皮细胞高水平表达，而在糖尿病所引起的脑血管损伤中表达尚不清楚。本实验通过观察该因子在脑血管中表达情况，并应用氨基胍及Baicalein 2种药物进行干预，探讨其对糖尿病大鼠脑组织的可能影响。

1 材料与方法

1.1 动物、试剂及仪器 8～9周龄SD大鼠48只，体质量180～200 g（郑州大学实验动物中心提供），链脲佐菌素（streptozocin，STZ）和氨基胍（美国sigma公司），Baicalein（上海楷洋生物技术有限公司），One-Touch-Ⅱ型血糖仪及试纸（美国强生公司），兔抗人EGFL-7多克隆抗体（北京博奥森生物技术有限公司）；免疫组化试剂盒、DAB试剂盒（北京中杉生物工程公司），Western二抗（Jackson ImmunoResearch公司），内参β-actin一抗（美国GenView公司），ECL化学发光试剂盒（PIERCE）。

1.2 动物模型的制备和分组 48只SD大鼠应用随机数字表法分为正常对照组、糖尿病组、氨基胍组和Baicalein组，每组12只，正常对照组给予普通饮食喂养；其余3组按照文献[4]的方法建立糖尿病大鼠模型，即先分别给予高脂高糖饮食（10.0％猪油、20.0％蔗糖、2.5％胆固醇、1％胆盐、66.5％普通饲料）喂养，喂养6周后，糖尿病组、氨基胍组及Baicalein组大鼠禁食不禁水12 h，于左下腹部腹腔注射30 mg/kg STZ溶液（临用前用0.1 mmol/L，pH 4.2的枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液配制成2％的溶液，避光进行，现配现用），正常对照组腹腔注射等体积的枸橼酸钠缓冲液，72 h后尾静脉采血，用One-Touth血糖仪测定血糖，以随机非空腹血糖＞16.7 mmol/L定为糖尿病模型，造模成功后，氨基胍组、Baicalein组分别给予氨基胍溶液、Baicalein溶液灌胃，剂量均为150 mg/（kg·d），正常对照组、糖尿病组给予等量生理盐水灌胃。各组大鼠均饲养16周，检测血糖、观察病情。

1.3 免疫组化法检测大鼠脑组织EGFL-7的表达 16周末，各组大鼠用10％水合氯醛（250 mg/kg）腹腔注射麻醉，开胸，用穿刺针小心插入左心室，同时剪开右心耳，生理盐水10 mL经心脏快速灌注，直至流出液体变清，再灌注4％多聚甲醛约250 mL，直到大鼠全身僵硬为止，开颅取出全脑，去掉脑干和小脑，4％多聚甲醛固定8 h，常规石蜡包埋切片，PBS冲洗3次，浸泡5 min/次，室温滴加3％H2O220 min，PBS冲洗3次，5 min/次，SP试剂盒说明书进行操作，一抗（EGFL-7，1∶100）二甲苯联苯胺（DAB）显色，镜下控制显色时间，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。EGFL-7的阳性计数表达采用在高倍镜（×400）下随机读取10个不重复视野，对染成浅棕色至深棕色血管数进行统计，取平均值。

1.4 蛋白免疫印迹法（Western blotting）检测大鼠脑EGFL-7蛋白的表达 于16周末各组大鼠水合氯醛腹腔注射麻醉后，迅速取脑，生理盐水冲洗，迅速置于液氮罐低温保存。从液氮罐中取出全脑，置于匀浆器中，按照每100 mg组织加入1 000 μL裂解液（RIPA）于冰上匀浆，4℃离心10 min；轻轻吸取上清，移至新的离心管中，-80℃保存备用。根据蛋白定量调整蛋白上样量，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，浓缩胶浓度12％，分离胶浓度5％，电压分别为浓缩胶80 V、分离胶120 V，半干转至PVDF膜上，5％脱脂奶粉封闭液封闭1 h，加入EGFL-7一抗，4℃孵育过夜，浓度为1∶500，用TBST摇床洗膜3次，每次5 min；加二抗，浓度1∶4 000，室温孵育2 h，同上洗涤，分别滴加内参一抗、二抗，ECL显色，X线片压片冲洗，扫描胶片上的条带，以目的蛋白灰度值与内参灰度值比值进行统计分析。

1.5 统计学方法 采用SPSS 17.0软件包进行统计分析，计量资料采用均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，多重比较采用LSD-t检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 免疫组织化学结果 EGFL-7的阳性表达为浅棕色至深棕色颗粒或呈条索状，主要表达于血管内皮上，见图1。与正常对照组相比，糖尿病组、氨基胍组、Baicalein组EGFL-7表达明显增加（P＜0.01）,与糖尿病组相比，氨基胍组、Baicalein组EGFL-7的表达明显减少（P＜0.01）；氨基胍组与Baicalein组表达差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

Tab.1 Expressions of EGFL-7 and the gray value of EGFL-7 in brain tissue in four groups表1 各组大鼠脑组织EGFL-7表达的阳性细胞数及相对灰度值 （±s）

Tab.1 Expressions of EGFL-7 and the gray value of EGFL-7 in brain tissue in four groups表1 各组大鼠脑组织EGFL-7表达的阳性细胞数及相对灰度值 （±s）

＊＊P＜0.01；a与正常对照组比较，b与糖尿病组比较，P＜0.01

相对灰度值（％）25.03±2.44 57.39±4.21a36.38±2.57ab33.45±5.22ab110.758＊＊组别正常对照组糖尿病组氨基胍组Baicalein组F n 12 12 12 12阳性细胞数0.39±0.69 18.80±2.62a14.10±1.97ab13.80±2.10ab15.598＊＊

2.2 Western blotting结果 与正常对照组比较，糖尿病组、氨基胍组、Baicalein组EGFL-7表达均明显增多（P＜0.01），与糖尿病组比较，氨基胍组、Baicalein组EGFL-7表达明显降低（P＜0.01），Baicalein组与氨基胍组比较，EGFL-7的表达差异无统计学意义(P＞0.05)，见图2，表1。

3 讨论

3.1 EGFL-7基因和蛋白结构 EGFL-7又被称为血管内皮抑制素（VE-statin），是一个分子质量为30 ku的蛋白，其在物种中的表达高度保守。EGFL-7转录起始点位于上游5.4 kb启动子片段，包含了2个保守位点组成，被称为Ets结合位点。在胚胎和成年组织的转基因小鼠，Ets转录因子结合位点是运载EGFL-7使其表达在内皮基因上的重要的结合位点[5]。EGFL-7启动子还包含1个GATA-2共识结合位点[6]，这两种结合位点使得EGFL-7对血液和血管内皮早期发育起到了重要作用。

3.2 EGFL-7与血管内皮重塑 目前研究发现，EGFL-7在促进血管内皮细胞的增殖、迁移、发芽以及浸润方面有重要的作用，并且与血管外基质的重塑相关[7]，如肿瘤血管的生成，炎症组织及动脉粥样硬化斑块等[8-9]。而在正常成熟组织中表达较低，说明EGFL-7表达的升高与血管生成有关。在De Mazière等[1]研究斑马鱼实验中消除了EGFL-7因子后，血管面积大量减少。在Schmidt等[2]研究也同样证实，敲除了EGFL-7的纯合子小鼠显示出异常状态的血管结构。Campagnolo等[3]研究表明，EGFL-7在损伤的动脉及动脉粥样硬化的管腔内皮大量表达。在分别用低氧和磷酸酶诱导的冠状动脉内皮细胞损伤中，EGFL-7可通过抑制核转录因子（NF）-κB及细胞间黏附分子-1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）的表达来刺激血管再生[10-11]。可见EGFL-7通过影响血管内皮细胞的迁移，成为促进内皮细胞血管重塑的关键。本实验发现，糖尿病大鼠脑组织中EGFL-7表达增多，表明大鼠脑组织存在内皮细胞损伤，血管再生系统激活，引起血管内皮细胞增生，导致血管增生和血管重塑。但其相关的机制和作用仍需进一步深入研究。

3.3 氨基胍及Baicalein对糖尿病大鼠脑血管内皮的保护作用 本实验还发现氨基胍及Baicalein能够降低EGFL-7的表达，起到保护脑血管的作用。氨基胍是一种亲质子肼类化合物，可阻止糖基化终末产物（AGEs）的生成，改善在高血糖状态下AGEs在血管壁上的积聚，从而减少对血管内皮细胞的损伤。但因为其不良反应较大，限制了临床应用。Baicalein又名黄芩素，是中药黄芩提取的黄酮类化合物，具有广泛的抗炎、抗氧化、抗病毒等药理作用，本实验结果显示，氨基胍、Baicalein在一定程度上参与了抑制血管再生及重建，改善血管内皮损伤的作用，因此相对于氨基胍的不良反应，Baicalein有望应用于糖尿病血管重塑的临床治疗。

Fig.1 Expressions of EGFL-7 in four groups（DAD staining,×400）图1 各组大鼠脑组织EGFL-7的表达（DAB染色，×400）

Fig.2 Expressions of EGFL-7 in brain tissue measured by Western blotting assay in four groups图2 Western blotting检测大鼠脑组织EGFL-7蛋白表达的结果

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（2014-01-10收稿 2014-07-17修回）

（本文编辑 李鹏）

The Expression of EGFL-7 in Brain Tissue of Type 2 Diabetic Rats and the Adjusting Function of Amioguanidine and Baicalein

WANG Qiong,LI Huimian△
Department of The Cadre Ward,The Second Affiliated Hospital of Zhengzhou University,Zhengzhou 450000,China△

E-mail:lihuimian630308@163.com

ObjectiveTo investigate the expression of epidermal growth factor-like domain 7(EGFL-7)in brain tissue of diabetes mellitus(DM)rats,and the intervene effect of amioguanidine and baicalein thereof.MethodsForty-eight SD rats were randomly divided into following four groups:control group,diabetic group,aminoguanidine group and baicalein group(n=12 for each group).The control group

only pelleted food and water.Diabetic group,aminoguanidine group and baicalein group were given high fat and sugar diet in combination with small dose of intraperitoneal injection of streptozotocin to establish the diabetic model.And then aminoguanidine group and baicalein group were given aminoguanidine and baicalein 150 mg/(kg·d)through oral gavaging.Diabetic group and control group were given equivalent saline through oral gavaging.After 16-week treatment,the expression of EGFL-7 proteins in rat brain was detected by immunohistochemistry and Western blotting methods.ResultsResultsof immunohistochemistry and Western blotting assay showed that the expression of EGFL-7 was significantly increased in diabetic group,aminoguanidine group and baicalein group compared with that of control group(P＜0.01).When compared with diabetic group,the expression of EGFL-7 was significantly decreased in aminoguanidine group and baicalein group(P＜0.01).There was no significant difference in the EGFL-7 expression between aminoguanidine group and baicalein group(P＞0.05).ConclusionEGFL-7 may play an important role in cerebral vascular hyperplasia and remodeling of diabetic rats.Aminoguanidine and baicalein restrained cerebral vessel growth by reducing the expression of EGFL-7.

diabetes mellitus,type 2；EGFL-7；amioguanidine；Baicalein;vascular hyperplsia;vascular remodeling

R743

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.11.003

河南省科技厅科技攻关项目（122102310603）

郑州大学第二附属医院干部病房（邮编450000）△

E-mail：lihuimian630308@163.com