靶向Ang-1的siRNA片段逆转人胃腺癌细胞株BGC-823侵袭表型的研究

邢玉新 王 卫 桑晓旻 赵元顺 张春泽

靶向Ang-1的siRNA片段逆转人胃腺癌细胞株BGC-823侵袭表型的研究

邢玉新1王 卫2桑晓旻2赵元顺3张春泽4△

目的 利用RNA干扰技术沉默人胃腺癌细胞株BGC-823中血管生成因子1（Ang-1）的表达，观察其对肿瘤侵袭性的抑制效果。方法设计靶向Ang-1的siRNA片段并转染人胃腺癌细胞株BGC-823；RT-PCR方法检测Ang-1的mRNA水平；Western Blot和细胞免疫荧光方法检测整合素β1、CD44V6和Ang-1的蛋白表达量和细胞定位；细胞黏附试验检测转染前后细胞黏附能力；Matrigel胶及Transwell双室培养体系检测癌细胞侵袭能力。结果RTPCR结果显示所设计的siRNA片段可有效沉默Ang-1的mRNA表达；整合素β1、CD44V6和Ang-1蛋白主要定位于肿瘤细胞胞浆和胞膜，其表达水平较转染siRNA片段前均有不同程度降低；细胞黏附能力和侵袭能力均明显降低（P＜0.01）。结论靶向Ang-1的siRNA技术可有效降低人胃腺癌细胞株BGC-823的侵袭能力，为胃癌基因治疗提供了新的思路。

血管生成素1；RNA干扰；胃肿瘤；肿瘤侵润；抗原,CD29；抗原,CD44

瘤细胞转移是恶性肿瘤的重要表征，也是肿瘤术后复发的主要原因[1]。血管生成因子1（angiopoietin-1,Ang-1）在促进肿瘤新生血管形成、降解周围基质和肿瘤细胞迁移过程中发挥重要作用，被视为肿瘤基因治疗的重要靶点[2]。RNA干扰（RNA interference，RNAi）是一种由双链RNA诱发的基因沉默现象，其机制是通过阻碍特定基因转录来抑制基因表达。本研究利用RNAi技术沉默人胃腺癌细胞株BGC-823中Ang-1的表达，从多角度观察其对胃腺癌细胞侵袭性的抑制效果。

1 材料与方法

1.1 实验材料 人胃腺癌细胞株BGC-823购自中科院上海生物细胞研究所；胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司；DMEM培养基、胰蛋白酶、Transwell培养皿购自美国Gibco公司；山羊抗人整合素β1抗体和兔抗人CD44V6抗体购自美国SANTA公司；兔抗人Ang-1抗体和免疫荧光检测试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司；转染试剂Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与siRNA转染 胃腺癌细胞株BGC-823在含10％胎牛血清的DMEM培养基中培养，培养液中加入100 U/mL青霉素和100 g/mL链霉素。每4～5 d传代1次。取生长状态良好的BGC-823细胞随机分为对照组和实验组，对照组转染siRNA-Cotrol，实验组转染siRNA-Ang-1，分别将siRNA-Cotrol和siRNA-Ang-1与Lipofectamine 2000在无血清DMEM中轻柔混合后静置20 min备用，用DMEM漂洗2次，加入Lipofectamine 2000-siRNA复合物，37℃、5％CO2细胞培养箱培养6 h，加入胎牛血清终止转染。Ang-1的siRNA靶序列为：5′-GCGATCCTTAGCACACTTGTAA-3′（登记号：AB009873），由上海吉玛制药技术有限公司合成。

1.2.2 RT-PCR检测Ang-1 mRNA表达 采用Trizol试剂一步法提取细胞总RNA，用分光光度计验证RNA纯度；逆转录为cDNA，以β-actin为内参进行PCR扩增。Ang-1引物：上游为5′-CAACGGTTGACTGGCTG-3′，下游为5′-GAATCGGTCTAAGACC-3′，扩增产物大小为193 bp；β-actin引物：上游为5′-GGCTGGGTTTCTGCTACGCT-3′，下游为5′-CATGTCTCGATCCCACTTAAC-3′，扩增产物大小为357 bp。反应参数：94℃预变性5 min，然后94℃50 s，56℃45 s，72℃45 s，共32个循环，再72℃延伸5 min；PCR产物于2％琼脂糖凝胶电泳分离，凝胶成像系统扫描成像，紫外灯下观察电泳条带，求得每个待测产物与β-actin产物吸光度（A）值之比，进行半定量分析。

1.2.3 Western Blot检测整合素β1、CD44V6和Ang-1蛋白表达 提取总蛋白，Bradford法蛋白定量。PAGE电泳，考马斯亮蓝染色蛋白分离满意，将蛋白转到PVDF膜上，Western封闭液封闭，滴加抗体4℃水平摇床过夜，各抗体稀释度为整合素β1（1∶1 000）、CD44V6（1∶1 500）、Ang-1（1∶500），次日加入辣根酶标记二抗。化学发光试剂盒显影，Bio-Rad凝胶成像系统扫描化学发光光密度值，Quantity One软件分析。

1.2.4 细胞免疫荧光检测整合素β1、CD44V6和Ang-1蛋白定位 转染前进行细胞爬片，3％H2O2消除过氧化物酶，山羊血清封闭30 min，加入一抗4℃过夜，各抗体稀释度为整合素β1（1∶1 000）、CD44V6（1∶1 500）、Ang-1（1∶500），加入罗丹明或绿色荧光素酶标记二抗（1∶200），hoechst 33258复染，封片后镜下观察。

1.2.5 细胞黏附试验 纤黏蛋白基底以50µL/孔包被96孔板，4℃过夜。胎牛血清白蛋白作为对照。0.25％胰蛋白酶消化细胞制成单细胞悬液，浓度为1×105/mL，每孔100µL，37℃培养1 h。用磷酸盐缓冲液轻柔洗去未黏附细胞，加入无血清DMEM培养液150µL，MTT液50µL，37℃培养4 h，每孔加入二甲基亚砜原液100µL，酶联免疫检测仪上测定各孔570 nm波长处A值，按以下公式计算出黏附率：黏附率=（实验组细胞A570值/对照组细胞A570值－1）×100％。

1.2.6 细胞侵袭实验 在Transwell上室的聚碳酸酯膜上加入Matrigel基质胶60 μL，37℃、30 min使基质胶凝固；将转染与未转染Ang-1 siRNA的BGC-823细胞按104个细胞/孔接种于Transwell上室，下室加入600 μL含10％胎牛血清的DMEM培养基。48 h后取出上室，湿棉签拭去膜表面未穿过膜的细胞，苏木素染色后封片。倒置显微镜下观察并计数穿过膜的细胞数。

1.3 统计学方法 应用SPSS 16.0软件对所有数据进行统计学处理，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Ang-1 mRNA表达 siRNA-Ang-1转染24 h后，BGC-823细胞表达的Ang-1 mRNA水平明显降低，至第48 h后开始持续在较低水平，但至72 h后又逐渐升高，见图1。

Fig.1 Ang-1 mRNA transcription after siRNA-Ang-1 transfection图1 siRNA-Ang-1转染后Ang-1 mRNA表达电泳图

2.2 整合素β1、CD44V6和Ang-1蛋白表达 提取的细胞总蛋白的时间点选在siRNA转染后48 h进行，实验组中整合素β1、CD44V6和Ang-1蛋白表达水平较对照组降低，见图2。

Fig.2 Expression of invasion related protein in siRNA-Ang-1 and siRNA-control group图2 Western Blot检测2组细胞侵袭相关蛋白表达

2.3 细胞免疫荧光结果 整合素β1、CD44V6和Ang-1主要表达于细胞浆和细胞膜部位，siRNAAng-1转染48 h后，上述各蛋白质对应的荧光强度均有明显降低，见图3。

2.4 细胞黏附及侵袭能力比较 对照组BGC-823细胞黏附率为（74.67±12.44）％，高于实验组的（30.34±7.27）％，（t=8.702，P＜0.05）。实验组从Transwell上室向下室迁移的细胞数量（17.29± 4.73）％，较对照组（45.71±9.13）％明显减少（t=7.818，P＜0.05），见图4。

3 讨论

胃癌是严重威胁人类生命健康的恶性肿瘤之一，当前临床多采用以手术为主，联合放、化疗等的综合措施予以治疗，但晚期胃癌患者术后5年生存率仍不足15％[3]。研究表明，胃癌的侵袭生长特性与瘤细胞的无控性增殖、周围基质降解、细胞黏附力增强及新生血管形成等有关[4]。通过基因干预手段影响上述分子事件发生和进展，对于降低癌细胞侵袭性，延长患者生命，争取手术最佳切除或二次手术机会有重要意义。

3.1 RNAi的作用及机制 RNAi是细胞本身固有的对抗外源基因及其侵害的一种自我保护现象，是双链RNA(dsRNA)分子在mRNA水平关闭相应序列及基因的表达使其沉默的过程。当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的dsRNA时，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默[5]。RNAi具有高效性、高特异性、高稳定性和高穿透性等特点[6]。RNAi抑制基因表达的效应可以穿过细胞界限，在不同细胞间长距离传递和维持。本研究针对Ang-1进行RNA干扰治疗，观察其对胃腺癌细胞侵袭性的影响。

3.2 Ang-1在胃癌细胞中的作用及机制 Ang-1是血管内皮细胞上酪氨酸激酶受体家族Tie2受体的配体，和血管表皮生长因子不同，Ang-1和Tie2受体的结合并不促进血管内皮细胞的增殖，而是通过调节内皮细胞与周围间质细胞的相互作用而发挥维持血管稳定、促进新生血管成熟化的作用。阻断Ang-1 和Tie2受体的结合可以发现肿瘤内新生血管内皮细胞和周围间质细胞缺乏紧密连接，血管分支不足且不能形成完整的管状结构[7]。细胞运动是肿瘤转移的基本条件，在整合素β家族中以整合素β1与胃癌转移关系最为密切，其介导细胞与细胞、细胞与基质之间的反应，参与细胞黏附和迁移等多个生理过程。新近研究发现，整合素β1也可作为受体与Ang-1结合，介导Ang-1的促黏附作用[8]。CD44V属于另一类黏附分子家族，分为CD44V（1～10）10种亚型，与透明质酸等配体结合，介导细胞与细胞、细胞与基质之间的黏附功能。陈慧娟等[9]研究发现Ang-l能明显提高人胃癌细胞BGC-823中整合素β1、 CD44V6的mRNA水平，从而促进肿瘤细胞的黏附和转移。本研究通过siRNA技术有效沉默了Ang-1 mRNA及蛋白水平的表达，并检测了其对整合素β1 和CD44V6的表达影响，结果显示经有效沉默人胃腺癌细胞株BGC-823中Ang-1的表达后，整合素β1 和CD44V6的表达水平发生同向性降低，提示Ang-1可能通过直接或间接协同作用，与整合素β1和CD44V6一起参与胃癌细胞的侵袭和转移过程，而靶向Ang-1的siRNA技术可有效抑制该恶性表型。

本实验所选用的Transwell双室培养皿的滤膜孔径为8 μm，由于膜孔被Matrigel覆盖，细胞不能自由穿过，必须分泌水解酶，并通过变形运动穿过这种铺有Martrigel的滤膜。以上两种材料的结合应用已成为当前研究肿瘤细胞侵袭和迁移能力的重要工具。本研究通过沉默人胃腺癌细胞株BGC-823中Ang-1的表达，发现该细胞系的侵袭和迁移能力明显降低。接下来课题组将尝试将这一技术在动物荷瘤鼠模型中加以验证。

Fig.3 The subcellular localization of invasion-related protein in siRNA-Ang-1 and siRNA-control group shown by cell Immunofluorescence(×400)图3 2组中侵袭相关蛋白的细胞定位表达(×400)

Fig.4 Cell migration and invasion were assessed using transwell migration and invasion assays in siRNA-Ang-1 and siRNA-control group(×200)图4 Transwell检测2组肿瘤细胞的迁移能力(×200)

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（2013-09-03收稿 2014-03-13修回）

（本文编辑 李鹏）

Study of Reversing Invasion of Human Gastric Cancer Cell Line BGC-823 by Targeting Angiopoietin-1 Using siRNA

XING Yuxin1，WANG Wei2，SANG Xianmin2，ZHAO Yuanshun3，ZHANG Chunze4
1 Department of General Surgery,Tianjin Occupational Prevention and Treatment Hospital＆Tianjin Worker’s Hospital, Tianjin 300011,China；2 Department of Anus＆Intestine Surgery,Tianjin Dagang Oil Field General Hospital；3 Department of Hepatobiliary Surgery and Liver Transplantation Center,Beijing YouAn Hospital,Capital Medical University；4 Department of Anus＆Intestine Surgery,Tianjin People’s Hospital ZHANG Chunze,E-mail:zhangchunzetj@163.com

ObjectiveTo knock down angiopoietin-1 expression in human gastric cancer cell line BGC-823 and to observe its effect of reversing tumor invasion.MethodssiRNA sequence fragments was designed to target angiopoietin-1 and transferred into human gastric cancer cell line BGC-823.RT-PCR was used to assess the transcription level of angiopoietin-1 mRNA,then western blot and immunofluorescence were used to examine the expression level of three invasion-associated proteins include integrin β1,CD44V6 and Ang-1.Cell adhesion ability was evaluated by cell adhesion assay and cell invation was determined by matrigel and transwell plastic dual-chamber culture system.ResultsAng-1 mRNA was knocked down by siRNA showed by RT-PCR.The expression of integrin β1,CD44V6 and Ang-1 were significantly lower than control group（P＜0.05）,so did the cellular adhesion and invasion abilities（P＜0.05）.ConclusionKnocking down angiopoietin-1 by siRNA can reverse invasion of human gastric cancer cell line BGC-823 and may provide new ideas and reference for gene therapy of gastric cancer in the future.

angiopoietin-1；RNA interference；stomach neoplasms；neoplasm invasiveness；antigens,CD29；antigens,CD44

R735.2

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.08.005

1天津市职业病防治院，天津市工人医院普通外科（邮编300011）；2天津海滨人民医院（大港油田总医院）肛肠外科；3首都医科大学附属北京佑安医院肝脏移植中心；4天津市人民医院肛肠外科

△通讯作者 E-mail:zhangchunzetj@163.com