当年生喜树种子的无菌发芽及幼苗生长

2014-07-02 01:26徐颖莹黄明亮单梅胡家金
关键词:侧根成苗无菌

徐颖莹,黄明亮,单梅,胡家金

(湖南农业大学生物科学技术学院,湖南 长沙 410128)

当年生喜树种子的无菌发芽及幼苗生长

徐颖莹,黄明亮,单梅,胡家金*

(湖南农业大学生物科学技术学院,湖南 长沙 410128)

以当年生新鲜喜树种子为材料,采用植物组织培养技术,研究其萌发及幼苗生长的适宜条件。结果表明,采用0.1% HgCl2和10% NaClO分别对外植体进行消毒后,以0.1% HgCl2进行果实消毒的种子萌发率最高,为41.11%;在此基础上用10% NaClO将预培养种子浸泡3 min后,其萌发率和成苗率显著提高,分别达85.56%和55.56%,而且幼苗生长状态好,平均生成侧根6~7条,主根长约10 cm;对未经处理的种子苗做切根处理,并转移到新鲜的MS培养基,幼苗生长效果与经10% NaClO处理过的种子苗的生长效果相同,但将其转移到含1 mg/L 6–BA的MS培养基后,种子苗的子叶变黄,无新根生成或只有1个短根生成。

喜树;种子;萌发率;成苗率;切根

喜树(Camptotheca acuminate Decne)是山茱萸目(Cornales)珙桐科(Nyssaceae)喜树属 (Camptotheae)多年生落叶乔木[1],可作为园林观赏及环境保护的绿化树种[2–4]。喜树是继红豆杉之后被发现的重要的木本抗癌药用植物[5–6]。喜树组织中含有的喜树碱(camptothecin, CPT) 具有抗癌活性[7–8],可以通过阻断癌细胞中 DNA拓扑异构酶 I (topoisomerase, TopoI) 的合成来阻止癌细胞的形成[9]。目前对喜树的研究多数是针对喜树碱的分离、提取与鉴定[10],喜树愈伤的诱导[4,8]和茎段的扦插快繁[6,11]等。关于喜树种子无菌发芽及幼苗生长的研究少见报道。喜树的无菌扦插繁殖受季节影响,愈伤组织诱导再生植株的周期较长,无菌苗的大量获得困难,故采用种子无菌发芽来解决该问题具有现实意义。鉴于喜树种子本身的休眠作用,其萌发率不高[12]。笔者从种子无菌发芽角度来研究当年生喜树种子的适宜萌发条件及喜树种子萌发率和成苗率的提高途径,旨在建立良好的喜树无菌苗培养体系。

1 材料和方法

1.1 材 料

当年生新鲜喜树果实采于湖南农业大学校园内。试验时剥取果实内种子接种。

采用MS基本培养基,各培养基均含3%的蔗糖和0.8%的琼脂,pH 5.8,高压灭菌。

1.2 方 法

1.2.1 种子和幼苗的培养条件

培养基分装于100 mL的三角瓶中,每瓶40 mL左右。接种时每个处理5瓶。每瓶接种6粒种子。重复3次。材料培养温度(25±2) ℃,光照度1 500~ 2 000 lx,光照时间16 h,相对湿度大于50%。

1.2.2 适宜外植体消毒方式的选取

将喜树果实和种子分别用流水冲洗干净,再用蒸馏水润洗2遍;于超净工作台内,用70%的乙醇表面消毒约60 s,再用无菌水冲洗1遍,然后将果实和种子分别进行消毒(T1:0.1% HgCl2果实消毒;T2:10% NaClO果实消毒;T3:0.1% HgCl2种子消毒;T4:10% NaClO种子消毒)。消毒时不时地摇动,10 min后倒去消毒液,并用无菌水反复冲洗3次以上。消毒后的种子直接接种于MS培养基上;果实则剥去果肉后接种于MS培养基中。观察并统计种子的萌发率。

1.2.3 预培养喜树种子的不同化学溶液处理

将喜树种子按 1.2.2中筛选出的适宜外植体消毒方式进行处理后预培养 15 d,再分别用 10% NaClO、1% NaClO和70%乙醇处理3 min,接种在新鲜的MS培养基上,各处理均接种30粒种子。以未经化学溶液处理的种子为对照。统计种子的萌发率和成苗率,并观察幼苗生长状态。

1.2.4 种子苗的切根处理及转移

将未经化学溶液处理的种子苗切去部分根部(留下与茎部相接的一小部分),并转移到分别附加了0、1 mg/L 6–BA的MS培养基上,观察切根处理后幼苗在不同培养基上的生长情况。

1.2.5 数据处理

试验数据采用Excel 2007和SPSS 16.0软件进行分析和处理。

2 结果与分析

2.1 喜树种子的萌发情况

2.1.1 不同外植体消毒方式下喜树种子的萌发率

表1结果表明,T1、T2处理喜树种子的萌发率较高,而T3、T4处理喜树种子的萌发率很低,且前者与后者之间的差异均达显著水平。考虑到用10% NaClO消毒的污染率较高,因此,采用T1处理(0.1% HgCl2果实消毒)进行后续试验。

表1 各消毒处理喜树种子的萌发情况Table 1 Effects of different treatments on seed germination of Camptotheca acuminate

2.1.2 化学溶液处理对喜树种子萌发的影响

表2结果表明:3种化学溶液处理都使喜树种子的萌发率得到了提高,其中以1% NaClO处理的效果最好,10% NaClO处理的效果次之,且均与对照差异显著,而70%乙醇处理与对照间的差异无统计学意义。由于1% NaClO处理的成苗率不高,所以,在后续试验中采用10% NaClO处理。

表2 不同化学溶液处理喜树种子的萌发率和成苗率Table 2 Effects of different chemical solution treatments on the rate of seed germination and seedling of Camptotheca acuminate

2.2 不同处理喜树幼苗的生长情况

2.2.1 化学溶液处理后喜树种子的成苗率和幼苗生长情况

由表2可见,经过3种化学溶液处理后,种子的成苗率以 10% NaClO处理的最高(显著高于对照),70%乙醇处理的最低(显著低于对照)。

试验结果表明,对照(未经任何处理)的幼苗无真叶长出,只有1条粗而短的主根,无侧根形成 (图1–a);经10% NaClO处理的幼苗生长较快,在相同的时间内可以较快地长出真叶,叶色深绿(图1–b),幼苗主根长达10 cm,在主根上生有6~7条长短不一的侧根,具有发达的根系(图 1–c)。可见,采用10% NaClO处理过的喜树种子生成的幼苗,其生长状态优于对照幼苗。

图1 对照和10% NaClO处理的喜树幼苗及其根系Fig. 1 Seedlings and roots under treatment of contrast and 10% NaClO

2.2.2 幼苗切根转移对其生长的影响

试验结果表明,种子萌发后在原培养基上生长缓慢,甚至生长停滞,这可能是由于培养基中的营养成分在种子萌发过程中被消耗殆尽,或者是种子萌发后在幼苗的周围形成了某种抑制生长的物质。

未经 10%NaClO处理的种子苗,切除其部分主根,并转移到新鲜MS培养基后,幼苗生长快,叶色青绿,植株健壮,而且根部形成较多的侧根,平均为7~8条,根长约9 cm (图2),而转移到含有1 mg/L 6–BA的MS培养基中的幼苗长势较弱,叶色发黄,也无侧根生成(图3)。

图2 切根后转移到MS培养基上生长1个月的幼苗及其根部Fig.2 Seedlings and roots growing in a month in MS medium after root-cut

图3 切根并转移到含1 mg/L 6–BA的MS培养基上生长1个月的幼苗及其根部Fig.3 Seedlings and roots growing in a month after root-cut and transferred to MS medium with 1 mg/L 6–BA

3 结论与讨论

a. 成熟的喜树种子具有较长的休眠期,采用适当的物理方法或化学方法可有效地打破种子休眠。剪破种皮可以打破喜树种子的休眠[13]。本研究结果表明,喜树果实消毒后去除果皮时,种子受到的机械划伤、种皮被割破等使种皮透气、透水,从而促进了种子的萌发。

b. 适当的化学方法浸泡种子可以软化种皮,去除一些种皮内的抑制物,促进种子萌发[15–16]。兰花碧玉春和独占春杂交种子无菌萌发试验,采用10% NaClO溶液浸泡种子10 min,提高了种子的萌发率[16]。王菲等[17]采用25% NaClO溶液浸泡树莓种子也得到了较高的种子发芽率。吕春华等[18]采用0.4% NaClO溶液浸泡青枫种子,其萌发率最高达到了67%。本研究中在0.1% HgCl2果实消毒的基础上采用10% NaClO溶液处理种子3 min,有效提高了喜树种子的萌发率,而且后期的成苗率也显著提高,长成的幼苗健壮,叶色浓绿,根系发达。

c.切断主根可以抑制主根的生长,促进侧根的发生[19–20]。其原因可能是切除部分主根后,苗木地上部分的水分供应减少,苗木的生长受到限制,从而根部被迫生长出更多的侧根和毛细根,以吸收水分供给苗木[21]。本研究中发现,对未经处理的种子苗做切根处理,并转移到新鲜的 MS培养基上后,幼苗生长可以达到与经10% NaClO处理过的种子苗相同的效果,其幼苗的根系发达,幼苗健壮,但培养基中含1 mg/L 6–BA时抑制了幼苗侧根的生成。

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责任编辑:王赛群

英文编辑:王 库

Aseptic germination and seedling growth of Camptotheca acuminate seeds on that very year

XU Ying-ying,HUANG Ming-liang,SHAN Mei,HU Jia-jin*
(College of Bioscience and Biotechnology,Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China)

The suitable condition of seeds germination and their growth were researched by taken fresh seeds of Camptotheca acuminate on that very year as materials through plant tissue culture. To compare the rate of seed germination, explants were disinfected with 0.1% HgCl2and 10% NaClO respectively. The result showed that rate of seed germination was the highest with 0.1% HgCl2disinfection, which achieved 41.11%. Further, rate of seed germination and seedling were significantly increased with 10% NaClO soak for 3 minutes on the basis of treatment of 0.1% HgCl2disinfection, which reached 85.56% and 55.56% respectively. Fresh seedlings grew well with an average of 6–7 lateral roots and a 10 cm long taproot. The growth of seedlings treated by root-cut and transferred in fresh MS medium were same as treatment with 10% NaClO. Seedlings, however, became yellow and had no new root or only one short root after transferred them to MS medium with 1 mg/L 6–BA .

Camptotheca acuminate; seeds; germination rate; seedling rate; root-cut

Q945.34

A

1007−1032(2014)03−0277−04

10.13331/j.cnki.jhau.2014.03.011

投稿网址:http://www.hunau.net/qks

2013–12–29

湖南省教育厅项目(08C430)

徐颖莹(1988—),女,河南平顶山人,硕士研究生,主要从事植物生物技术研究,gxqdjs@126.com;*通信作者,jjhu3@ sohu.com

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