枯草芽孢杆菌S44菌株ituD基因敲除突变株的构建

张慧　陈莉　赵思峰

摘要：利用同源重组基因敲除方法构建了枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）S44 ituD基因同源突变株。菌落PCR、RT-PCR、SDS-PAGE结果均显示ituD基因缺失突变株构建成功。野生株与突变株的菌落形态、生长速率以及抑菌活性均有显著差异。抑菌活性试验结果显示，突变株抑菌活性显著减弱，成功构建的ituD基因突变株为进一步研究ituD基因的生物学功能奠定了基础。

关键词：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）；ituD基因；敲除突变株；抑菌活性

中图分类号：Q78 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）06-1436-04

Construction of the ituD Gene Knockout Mutant of Bacillus subtilis S44

ZHANG Hui，CHEN Li，ZHAO Si-feng

（Key Laboratory of Xinjiang Uygur Autonomous Region for Oasis Agricultural Pest Management and Utilization of Plant Protection Resource/College of Agriculture， Shihezi University， Shihezi 832003， Xinjiang，China）

Abstract： To approach the relationship between the ituD gene and the antifungal activity of Bacillus subtilis S44， an isogenic knockout mutant of ituD gene was generated based on the principle of homologous recombination and confirmed by PCR， reverse transcription polymerase chain reaction and SDS-PAGE. The resulting mutant strain exhibited growth kinetics different from those of the WT parent strain upon cultivation in standard laboratory used in our in vitro assays. The morphology， growth rate and antifungal activity of wild type and mutant colony were significantly different. Antifungal activity results showed antifungal activity mutants were significantly reduced. The ituD mutant was successfully constructed for further study on ituD gene biological function basis.

Key words： Bacillus subtilis； ituD gene； knockout mutant； antifungal activity

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）可产生抗菌脂肽、水解酶等多种胞外代谢物，致使植物病原菌菌丝畸形、原生质浓缩、抑制孢子萌发以及菌丝端破裂，这是其防治植物病害的主要机理之一[1，2]。由非核糖体途径合成的脂肽类抗生素是其中最常见的一类，主要包括iturin、surfactin和fengycin 3个家族[3]。iturin家族中的iturin A对多种植物病原真菌有很强的抑菌活性，同时抑菌谱非常广，已被公认为是一种理想的可生物合成的杀菌剂[4]，同时因其抑菌谱广、对哺乳动物低毒和低致敏性，在人和动物药物开发方面也表现出广阔的应用前景[5]。iturin A操纵子由ituD、ituA、ituB和ituC 4个开放阅读框组成，其中ituD基因编码丙二酰CoA转移酶，该基因的缺失将导致iturin A产生的缺乏[6]，通过同源重组构建枯草芽孢杆菌UMAF6639 ituD基因缺失的突变株，发现该突变株没有产生iturin A的能力[7]。本研究中所用枯草芽孢杆菌S44是从新疆维吾尔自治区棉田根际土壤中分离获得，对多种植物病原菌具有很强抑制作用，对棉花黄萎病[8]、棉苗烂根病[9]以及加工番茄土传病害[10]均表现出了良好的防病效果，同时已从该菌株中克隆到了与iturin A合成密切相关的ituD基因[11]。本研究采用同源重组基因敲除方法构建了ituD基因缺失株，建立了枯草芽孢杆菌基因缺失株的构建方法，为进一步研究枯草芽孢杆菌抑菌机理和应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和质粒 枯草芽孢杆菌S44分离自新疆维吾尔自治区棉田土壤中；立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）分离自棉花立枯病病样；大肠杆菌（E.coli）DH5α，质粒pBR322，pUC18，pMD18-T购自宝生物工程（大连）有限公司。

1.1.2 主要试剂及仪器 DNA限制性内切酶、TaqDNA 聚合酶、T4 DNA连接酶购自宝生物工程（大连）有限公司；凝胶回收试剂盒、质粒小量提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；TransZol Up试剂购自北京全式金生物技术有限公司；cDNA第一链合成试剂盒购自Invitrogen公司；Gene Pulser Xcell TM型电穿孔仪及电转杯为Bio-Rad公司产品。引物合成和基因测序由北京六合华大基因科技有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 ituD基因的克隆与测序 根据已报道的枯草芽孢杆菌ituD基因特异性引物[12]，并分别在上、下游引物中加入BamHⅠ和SphⅠ位点，引物序列见表1。以枯草芽孢杆菌S44 基因组DNA为模板，用引物ituD-F/R经PCR扩增出大小约为1.2 kb的DNA片段，回收DNA片段并连接于pMD18-T载体上，转化大肠杆菌DH5α，在含有氨苄青霉素的麦康凯平板上培养，挑取阳性克隆菌落，PCR鉴定为阳性的克隆由北京六合华大基因科技有限公司测序。提取质粒双酶切验证，得到重组质粒pMD18-T-ituD。

1.2.2 tet标记基因的克隆与测序 参照文献[13]，以质粒pBR322为模板，用引物T-up、T-down扩增tet基因，引物序列见表1。PCR扩增出1.3 kb的片段，回收DNA片段并连接于pMD18-T载体上，转化大肠杆菌DH5α，在含有氨苄青霉素的麦康凯平板上培养，挑取阳性克隆菌落，PCR鉴定为阳性的克隆由北京六合华大基因科技有限公司测序。

1.2.3 敲除质粒pUC18-ituD：：tet的构建 分别用BamHⅠ和Sph I双酶切重组质粒pMD18-T-ituD和pUC18，分别获得1 200 bp和2 500 bp的线性片段。将酶切片段连接转化入大肠杆菌DH5α后，进行红白斑筛选。重组克隆质粒经PCR鉴定和双酶切鉴定正确后进行测序，得到重组质粒pUC18-ituD。再分别用ClaⅠ酶切pMD18-T-tet和pUC18-ituD，将酶切下来的抗性基因tet与酶切的pUC18-ituD质粒进行连接转化，经酶切验证得到敲除质粒pUC18-ituD：：tet。

1.2.4 突变株的筛选与鉴定 参照陆雁等[14]的方法制备枯草芽孢杆菌感受态细胞。在1.8 kV/cm、600 Ω和25 μF电转参数下，将构建好的敲除载体pUC18-ituD：：tet转入枯草芽孢杆菌S44感受态细胞，将电转化产物涂布于含四环素（5 μg/mL）的LB固体培养基上，37 ℃倒置培养16～24 h后，以单菌落为模板，以ituD-F/R为引物进行PCR初步筛选。

1）突变株的DNA测序鉴定。为了验证ituD基因是否插入tet基因，用引物ituD-F和ituD-R对突变株基因组DNA进行PCR扩增。同时对ituD-F/R扩增的PCR产物克隆于pMD18-T载体中，挑取阳性克隆菌落，PCR鉴定为阳性的克隆送北京六合华大基因科技有限公司测序。

2）RT-PCR鉴定。将野生株和突变株接种于NA培养基，30 ℃培养12 h，离心收集菌体，用TransZol Up试剂提取总RNA，以此为模板合成cDNA 第一链，并利用ituD基因引物ituD-F/R对cDNA进行PCR鉴定。

3）SDS-PAGE鉴定。制备野生株和突变株的全菌蛋白，经12% SDS-PAGE电泳。

1.2.5 突变株的生物学特性

1）生长速率比较。分别挑取野生株和突变株的单菌落接种于NA培养基，30 ℃过夜培养后，按3∶100（体积比）转接到NA培养基中，30 ℃继续培养，每隔3 h测定菌液的 OD600 nm，直至细菌生长处于稳定期，绘制生长曲线，同时观察细菌的菌落形态。

2）抑菌活性检测。分别取培养50 h的野生株和突变株菌液，12 000 r/min离心15 min，上清液用0.22 μm的过滤器过滤，以立枯丝核菌作为检测菌株，分别对野生株和突变株抑菌活性进行测定。

2 结果与分析

2.1 敲除载体pUC18-ituD：：tet的鉴定

提取质粒pUC18-ituD：：tet进行酶切与双酶切验证（图1），用限制性内切酶BamHⅠ和SphⅠ、SphⅠ、ClaⅠ和BamHⅠ酶切pUC18-ituD：：tet后，分别获得大小约为2.5、2.0、1.3、1.2和1.1 kb的DNA片段，条带均与预期大小相符，DNA测序结果也显示DNA片段序列及连接顺序正确。

2.2 突变株S1的筛选与鉴定

将提取的质粒pUC18-ituD：：tet通过电转化法将其导入枯草芽孢杆菌S44感受态细胞，在含有5 μg/mL四环素的LB平板上筛选阳性转化子，这些转化子产生于两种转化途径， 即同源重组和非同源重组，为了进一步鉴定重组为发生在ituD基因位点的双交换重组，即抗性基因tet片段正确插入到ituD基因之中，提取转化子的染色体DNA为模板，进行PCR检测。如果在ituD位点没有发生双交换重组，PCR产物大小应该在1.2 kb。如果ituD基因位点发生了双交换重组，tet片段通过交换插入到ituD基因中，则PCR产物大小应该在2.5 kb左右。

对转化子进行 PCR检测，发现只有枯草芽孢杆菌S1扩增到约2.5 kb的特异片段（图2），其他转化子无特异性条带，结果初步表明枯草芽孢杆菌S1为ituD基因缺失突变株。

2.2.1 突变株S1 DNA测序鉴定 为从核苷酸序列水平进一步证明突变株S1确实发生了ituD基因的缺失，以突变株S1的染色体DNA为模板扩增出约2.5 kb的特异性片段用胶试剂盒回收，然后连接入pMD18-T载体，转化入大肠杆菌DH5α，进行蓝白斑筛选。重组克隆质粒进行PCR检测和测序，序列测定结果与预期完全一致。

2.2.2 RT-PCR验证 利用TransZol Up试剂提取细菌野生株S44和突变株S1的总RNA。用引物ituD-F/R分别对野生株S44和突变株S1反转录得到的 cDNA 进行PCR扩增。结果表明，野生株S44中PCR扩增结果为阳性，说明ituD基因正常转录，而在突变株S1中为阴性，从转录水平证实ituD基因的缺失（图3）。

2.2.3 SDS-PAGE验证 如果ituD基因被敲除后，突变株S1不能表达ituD蛋白质，而该蛋白质在野生株S44均能正常表达。SDS-PAGE结果表明，在野生株S44全菌蛋白质中能观察到分子质量45 ku的蛋白质条带，而在突变株S1的全菌蛋白中没有观察到该蛋白质（图4）。

2.3 突变株S1的生长速率

将野生株S44和突变株S1接种于LB平板培养 24 h后，可见突变株S1长出为淡灰白色、圆形、边缘整齐、表面光滑的菌落，而野生菌株S44菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色；突变株S1的菌落直径较野生株小。由图5可知，野生株S44对数生长期生长速度较突变株S1迟缓，在生长前期，突变株S1生长快于野生株S44，后期野生株S44快于突变株S1，且野生株S44的OD600 nm大于突变株S1。

2.4 突变株S1抑菌活性的影响

将ituD基因缺失株在PDA平板上进行抑菌活性检测（图6），以野生株S44作为对照，发现ituD基因缺失株没有抑菌活性，验证了ituD基因与抑菌物质的产生密切相关。

3 小结与讨论

本研究为探讨ituD基因的功能，构建了一个含tet基因的两侧具有与ituD基因同源序列的同源敲除载体pUC18-ituD：：tet，通过敲除载体和枯草芽孢杆菌S44株基因组DNA之间的同源重组获得了缺失ituD基因的突变株S1，并通过PCR、RT-PCR和SDS-PAGE对敲除株在基因、转录和蛋白水平上进行了鉴定，结果证实突变株构建成功。获得敲除突变株后通过生物学功能试验比较了野生株S44和突变株S1在生长速率、菌落形态和抑菌活性等方面的差异。生长曲线结果显示，与野生株S44相比，突变株S1对数生长前期速率较快，后期明显慢于野生株。菌落形态观察显示，与野生株S44相比突变株S1在LB平板上长出表面光滑的小菌落。抑菌活性试验结果显示，与野生株S44相比突变株S1对立枯丝核菌的抑菌活性相对较弱，几乎没有抑菌活性。本研究对ituD基因的敲除不仅进一步验证了ituD基因在iturin A合成中的功能，同时也建立了枯草芽孢杆菌功能基因缺失株的构建方法，为枯草芽孢杆菌S44中其他基因的敲除及功能研究奠定了技术基础， 对于开展枯草芽孢杆菌蛋白组研究也具有非常重要的意义。

参考文献：

[1] BAYSAL ？魻，LAI D， XU H H，et al. A proteomic approach provides new insights into the control of soil-borne plant pathogens by Bacillus species[J]. PLoS ONE，2013，8（1）：e53182.

[2] TERESA O R， ZENIA G G，MANUEL S D，et al. In vitro growth inhibition of Curvularia gudauskasii by Bacillus subtilis[J].Annals of Microbiology，2012，62（2）：545-551.

[3] STEIN T. Bacillus subtilis antibiotics： Structures，syntheses and specific functions[J]. Molecular Microbiology，2005，56（4）：845-857.

[4] YAO S Y，GAO X W，FUCHSBAUER N，et al. Cloning sequencing， and characterization of the genetic region relevant to biosynthesis of the lipopeptides Iturin A and surfactin in Bacillus subtilis[J].Current Microbiology，2003，47（4）：272-277.

[5] DUITMAN E H，HAMOEN L W，REMBOLD M，et al.The mycosubtilin synthetase of Bacillus subtilis ATCC6633：A multifunctional hybrid between a peptide synthetase，an amino transferase， and a fatty acid synthase[J]. Proc Natl Acad Sci USA， 1999，96（23）：13294-13299.

[6] GROVER M，NAIN L，SINGH S B，et al.Molecular and biochemical approaches for characterization of antifungal trait of a potent biocontrol agent Bacillus subtilis RP24[J]. Current Microbiology，2010，60（2）：99-105.

[7] ROMERO D，VICENTE D A，RAKOTOALY R H，et al. The iturin and fengycin families of lipopeptides are key factors in antagonism of Bacillus subtilis toward Podosphaera fusca[J]. Molecular Plant-Microbe Interactions，2007，20（4）：430-440.

[8] 罗艳娜，杜 娟，李俊华，等. 滴管条件下枯草芽孢杆菌S37和S44对棉花黄萎病的防病效果[J].植物保护，2011，37（2）：174-176，181.

[9] 罗艳娜，杜 娟，李俊华，等.棉花立枯病拮抗菌的筛选及鉴定[J].石河子大学学报（自然科学版），2010，28（5）：555-560.

[10] 陶 晶，赵思峰，吴 艳，等.芽孢杆菌SL-23和SL-44对加工番茄防病促生效果的研究[J].新疆农业科学，2006，43（5）：362-365.

[11] 任 娟，孙佰平，杜 娟，等.枯草芽孢杆菌S44菌株ituD基因的克隆及原核表达[J].石河子大学学报（自然科学版），2012，30（5）：577-581.

[12] HSIEH F C，LIN T C，MENG M， et al. Comparing methods for identifying Bacillus strains capable of producing the antifugal lipopeptide iturin A[J]. Current Microbiology，2008，56（1）：1-5.

[13] 张 岚.副干酪乳杆菌HD1.7 prcK基因敲除载体构建及其电转化条件初步确立[D].哈尔滨：黑龙江大学，2008.

[14] 陆 雁，王青艳，朱绮霞，等.枯草芽孢杆菌高效转化及其转化子验证方法[J].广西科学院学报，2012，28（2）：117-119.

2.3 突变株S1的生长速率

将野生株S44和突变株S1接种于LB平板培养 24 h后，可见突变株S1长出为淡灰白色、圆形、边缘整齐、表面光滑的菌落，而野生菌株S44菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色；突变株S1的菌落直径较野生株小。由图5可知，野生株S44对数生长期生长速度较突变株S1迟缓，在生长前期，突变株S1生长快于野生株S44，后期野生株S44快于突变株S1，且野生株S44的OD600 nm大于突变株S1。

2.4 突变株S1抑菌活性的影响

将ituD基因缺失株在PDA平板上进行抑菌活性检测（图6），以野生株S44作为对照，发现ituD基因缺失株没有抑菌活性，验证了ituD基因与抑菌物质的产生密切相关。

3 小结与讨论

本研究为探讨ituD基因的功能，构建了一个含tet基因的两侧具有与ituD基因同源序列的同源敲除载体pUC18-ituD：：tet，通过敲除载体和枯草芽孢杆菌S44株基因组DNA之间的同源重组获得了缺失ituD基因的突变株S1，并通过PCR、RT-PCR和SDS-PAGE对敲除株在基因、转录和蛋白水平上进行了鉴定，结果证实突变株构建成功。获得敲除突变株后通过生物学功能试验比较了野生株S44和突变株S1在生长速率、菌落形态和抑菌活性等方面的差异。生长曲线结果显示，与野生株S44相比，突变株S1对数生长前期速率较快，后期明显慢于野生株。菌落形态观察显示，与野生株S44相比突变株S1在LB平板上长出表面光滑的小菌落。抑菌活性试验结果显示，与野生株S44相比突变株S1对立枯丝核菌的抑菌活性相对较弱，几乎没有抑菌活性。本研究对ituD基因的敲除不仅进一步验证了ituD基因在iturin A合成中的功能，同时也建立了枯草芽孢杆菌功能基因缺失株的构建方法，为枯草芽孢杆菌S44中其他基因的敲除及功能研究奠定了技术基础， 对于开展枯草芽孢杆菌蛋白组研究也具有非常重要的意义。

参考文献：

[1] BAYSAL ？魻，LAI D， XU H H，et al. A proteomic approach provides new insights into the control of soil-borne plant pathogens by Bacillus species[J]. PLoS ONE，2013，8（1）：e53182.

[2] TERESA O R， ZENIA G G，MANUEL S D，et al. In vitro growth inhibition of Curvularia gudauskasii by Bacillus subtilis[J].Annals of Microbiology，2012，62（2）：545-551.

[3] STEIN T. Bacillus subtilis antibiotics： Structures，syntheses and specific functions[J]. Molecular Microbiology，2005，56（4）：845-857.

[4] YAO S Y，GAO X W，FUCHSBAUER N，et al. Cloning sequencing， and characterization of the genetic region relevant to biosynthesis of the lipopeptides Iturin A and surfactin in Bacillus subtilis[J].Current Microbiology，2003，47（4）：272-277.

[5] DUITMAN E H，HAMOEN L W，REMBOLD M，et al.The mycosubtilin synthetase of Bacillus subtilis ATCC6633：A multifunctional hybrid between a peptide synthetase，an amino transferase， and a fatty acid synthase[J]. Proc Natl Acad Sci USA， 1999，96（23）：13294-13299.

[6] GROVER M，NAIN L，SINGH S B，et al.Molecular and biochemical approaches for characterization of antifungal trait of a potent biocontrol agent Bacillus subtilis RP24[J]. Current Microbiology，2010，60（2）：99-105.

[7] ROMERO D，VICENTE D A，RAKOTOALY R H，et al. The iturin and fengycin families of lipopeptides are key factors in antagonism of Bacillus subtilis toward Podosphaera fusca[J]. Molecular Plant-Microbe Interactions，2007，20（4）：430-440.

[8] 罗艳娜，杜 娟，李俊华，等. 滴管条件下枯草芽孢杆菌S37和S44对棉花黄萎病的防病效果[J].植物保护，2011，37（2）：174-176，181.

[9] 罗艳娜，杜 娟，李俊华，等.棉花立枯病拮抗菌的筛选及鉴定[J].石河子大学学报（自然科学版），2010，28（5）：555-560.

[10] 陶 晶，赵思峰，吴 艳，等.芽孢杆菌SL-23和SL-44对加工番茄防病促生效果的研究[J].新疆农业科学，2006，43（5）：362-365.

[11] 任 娟，孙佰平，杜 娟，等.枯草芽孢杆菌S44菌株ituD基因的克隆及原核表达[J].石河子大学学报（自然科学版），2012，30（5）：577-581.

[12] HSIEH F C，LIN T C，MENG M， et al. Comparing methods for identifying Bacillus strains capable of producing the antifugal lipopeptide iturin A[J]. Current Microbiology，2008，56（1）：1-5.

[13] 张 岚.副干酪乳杆菌HD1.7 prcK基因敲除载体构建及其电转化条件初步确立[D].哈尔滨：黑龙江大学，2008.

[14] 陆 雁，王青艳，朱绮霞，等.枯草芽孢杆菌高效转化及其转化子验证方法[J].广西科学院学报，2012，28（2）：117-119.

2.3 突变株S1的生长速率

将野生株S44和突变株S1接种于LB平板培养 24 h后，可见突变株S1长出为淡灰白色、圆形、边缘整齐、表面光滑的菌落，而野生菌株S44菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色；突变株S1的菌落直径较野生株小。由图5可知，野生株S44对数生长期生长速度较突变株S1迟缓，在生长前期，突变株S1生长快于野生株S44，后期野生株S44快于突变株S1，且野生株S44的OD600 nm大于突变株S1。

2.4 突变株S1抑菌活性的影响

将ituD基因缺失株在PDA平板上进行抑菌活性检测（图6），以野生株S44作为对照，发现ituD基因缺失株没有抑菌活性，验证了ituD基因与抑菌物质的产生密切相关。

3 小结与讨论

本研究为探讨ituD基因的功能，构建了一个含tet基因的两侧具有与ituD基因同源序列的同源敲除载体pUC18-ituD：：tet，通过敲除载体和枯草芽孢杆菌S44株基因组DNA之间的同源重组获得了缺失ituD基因的突变株S1，并通过PCR、RT-PCR和SDS-PAGE对敲除株在基因、转录和蛋白水平上进行了鉴定，结果证实突变株构建成功。获得敲除突变株后通过生物学功能试验比较了野生株S44和突变株S1在生长速率、菌落形态和抑菌活性等方面的差异。生长曲线结果显示，与野生株S44相比，突变株S1对数生长前期速率较快，后期明显慢于野生株。菌落形态观察显示，与野生株S44相比突变株S1在LB平板上长出表面光滑的小菌落。抑菌活性试验结果显示，与野生株S44相比突变株S1对立枯丝核菌的抑菌活性相对较弱，几乎没有抑菌活性。本研究对ituD基因的敲除不仅进一步验证了ituD基因在iturin A合成中的功能，同时也建立了枯草芽孢杆菌功能基因缺失株的构建方法，为枯草芽孢杆菌S44中其他基因的敲除及功能研究奠定了技术基础， 对于开展枯草芽孢杆菌蛋白组研究也具有非常重要的意义。

参考文献：

[1] BAYSAL ？魻，LAI D， XU H H，et al. A proteomic approach provides new insights into the control of soil-borne plant pathogens by Bacillus species[J]. PLoS ONE，2013，8（1）：e53182.

[2] TERESA O R， ZENIA G G，MANUEL S D，et al. In vitro growth inhibition of Curvularia gudauskasii by Bacillus subtilis[J].Annals of Microbiology，2012，62（2）：545-551.

[3] STEIN T. Bacillus subtilis antibiotics： Structures，syntheses and specific functions[J]. Molecular Microbiology，2005，56（4）：845-857.

[4] YAO S Y，GAO X W，FUCHSBAUER N，et al. Cloning sequencing， and characterization of the genetic region relevant to biosynthesis of the lipopeptides Iturin A and surfactin in Bacillus subtilis[J].Current Microbiology，2003，47（4）：272-277.

[5] DUITMAN E H，HAMOEN L W，REMBOLD M，et al.The mycosubtilin synthetase of Bacillus subtilis ATCC6633：A multifunctional hybrid between a peptide synthetase，an amino transferase， and a fatty acid synthase[J]. Proc Natl Acad Sci USA， 1999，96（23）：13294-13299.

[6] GROVER M，NAIN L，SINGH S B，et al.Molecular and biochemical approaches for characterization of antifungal trait of a potent biocontrol agent Bacillus subtilis RP24[J]. Current Microbiology，2010，60（2）：99-105.

[7] ROMERO D，VICENTE D A，RAKOTOALY R H，et al. The iturin and fengycin families of lipopeptides are key factors in antagonism of Bacillus subtilis toward Podosphaera fusca[J]. Molecular Plant-Microbe Interactions，2007，20（4）：430-440.

[8] 罗艳娜，杜 娟，李俊华，等. 滴管条件下枯草芽孢杆菌S37和S44对棉花黄萎病的防病效果[J].植物保护，2011，37（2）：174-176，181.

[9] 罗艳娜，杜 娟，李俊华，等.棉花立枯病拮抗菌的筛选及鉴定[J].石河子大学学报（自然科学版），2010，28（5）：555-560.

[10] 陶 晶，赵思峰，吴 艳，等.芽孢杆菌SL-23和SL-44对加工番茄防病促生效果的研究[J].新疆农业科学，2006，43（5）：362-365.

[11] 任 娟，孙佰平，杜 娟，等.枯草芽孢杆菌S44菌株ituD基因的克隆及原核表达[J].石河子大学学报（自然科学版），2012，30（5）：577-581.

[12] HSIEH F C，LIN T C，MENG M， et al. Comparing methods for identifying Bacillus strains capable of producing the antifugal lipopeptide iturin A[J]. Current Microbiology，2008，56（1）：1-5.

[13] 张 岚.副干酪乳杆菌HD1.7 prcK基因敲除载体构建及其电转化条件初步确立[D].哈尔滨：黑龙江大学，2008.

[14] 陆 雁，王青艳，朱绮霞，等.枯草芽孢杆菌高效转化及其转化子验证方法[J].广西科学院学报，2012，28（2）：117-119.