油橄榄叶中总黄酮的提取工艺优化

罗茜

摘要：以油橄榄（Olea europaea L.）叶片为原料，以芦丁为对照品，以乙醇体积分数、提取温度、料液比、回流时间为考察因素，以总黄酮提取率为指标，先通过单因素试验，再采用正交试验设计优选提取工艺。结果表明，最佳提取工艺为乙醇体积分数90 %、提取温度60 ℃、料液比1∶19、回流时间1.5 h，在此条件下，总黄酮的提取率为2.280%。该提取工艺合理、简单，可用于大规模生产。

关键词：正交设计；油橄榄（Olea europaea L.）叶；总黄酮

中图分类号：S667.5；TS201.2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）06-1406-03

Optimization of Extracting Total Flavonoids from Olive Leaf

LUO Qian

（School of Applied and Chemical Engineering， Xichang College，Xichang 615013， Sichuan，China）

Abstract： Using olive leaf as materials， rutin as control， and ethanol concentration， extraction temperature， material to solvent， refluxing extraction time as evaluation factors and the extraction rate of the total flavonoids as an indicator， the technology extracting the total flavonoids from olive leaf was optimized with single-factor experiment and orthogonal design. The results showed that the optimal technology were ethanol concentration 90%， extraction temperature 60 ℃， material to solvent 1∶19， refluxing extraction time 1.5 h. The extraction ratio of flavonoids was 2.2815% under the optimized conditions. The extraction method was reasonable and simple， and could be used for industrial production.

Key words： orthogonal experiment； olive（Olea europaea L.） leaf； total flavonoids

油橄榄（Olea europaea L.）为木犀科木樨榄属植物，常绿阔叶乔木，又名洋橄榄、齐敦果[1]。最近几年，随着人们物质生活水平的提高，对营养保健的要求也逐年提高。油橄榄果虽可加工成素有“植物油皇后”之称的橄榄油，但是我国的橄榄油产量并不大，目前主要依靠进口。国内外对于橄榄油的报道较多，但是油橄榄的果渣、废水和橄榄叶还鲜有研究报道。

国外的油橄榄叶提取物已经广泛应用于化妆品、食品和药品[2]。油橄榄叶中活性成分主要有有机酸、蛋白质、氨基酸、黄酮等[3]，即说明可大力发展利用油橄榄叶片。

总黄酮是一类具有生理活性的物质，广泛分布于植物界中，它的生理活性形式多种多样，总黄酮具有抗氧化，抗肿瘤等生物学功效，也具有其他的保健养生的功能。目前已从多种植物中提取出总黄酮[4-10]。因此从油橄榄叶片中提取总黄酮具有重要的意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

油橄榄叶片样品由凉山州国家油橄榄良种基地提供，品种为科拉蒂。三氯化铝（成都市科龙化工试剂厂）；95%乙醇（工业酒精），所有试剂均为分析纯。

1.2 仪器

98-1-BWAY-2S型电子调温电热套（天津市泰斯特有限公司）；WAY-2S型阿贝折射仪（上海精密科学仪器有限公司）；722S型可见分光光度计（上海菁华科技仪器有限公司）；HH-4型数显恒温水浴锅（金坛市杰瑞尔电器有限公司）；SHZ-Ⅲ型循环水真空泵（上海亚荣生化仪器厂）；ZN-400A型微型高速粉碎机（长沙市岳麓区中南制药厂）；ETTLERAE240型电子天平（瑞士METTLER公司）

1.3 试验方法

1.3.1 材料预处理 将采摘的油橄榄叶片置于实验室自然阴干，干燥后的油橄榄叶片于微型高速粉碎机粉碎，放在干燥器皿中备用。

1.3.2 单因素试验 称取10 g干燥的油橄榄叶片粉末，置于250 mL 圆底烧瓶中，在不同条件下提取，以确定提取因素变化范围以及各因素的较佳值。

1.3.3 正交试验 以乙醇、提取温度、料液比、回流时间4个因素作为考察对象，采用正交试验 L9（34）对样品中的总黄酮进行提取（表1），以总黄酮提取率为指标，进行试验优化，确定最佳的提取工艺条件。

1.3.4 标准曲线的绘制 从芦丁标准溶液（0.079 2mg/mL）中精确移取 0.0、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5 mL芦丁标准溶液置于25 mL容量瓶中，分别加30%乙醇至12.5 mL，摇匀，再分别加入10 mL 1%的AlCl3溶液，用30%乙醇溶液定容，摇匀放置15 min后，在415 nm下测定吸光度，结果见图1。所得线性回归方程A=29.904 0C+0.013 8，r2=0.999 6。

1.3.5 总黄酮测定方法 量取样品溶液2.5 mL置于25 mL容量瓶中，按照“1.3.4”的方法测定吸光度。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 乙醇体积分数对总黄酮提取率的影响 称取10 g样品粉末，分别用 60%、70%、80%、90%、95%乙醇溶液为溶剂，然后在提取温度80 ℃，料液比（m/v，g∶mL，下同）1∶13的条件下，水浴加热回流2 h，真空抽滤两次，常压蒸馏回收乙醇，浓缩液用去离子水定容至250 mL，静置沉淀24 h，取上清液10 mL，用60%乙醇定容至100 mL，即样品溶液。取样品溶液2.5 mL按照“1.3.4”的方法测定样品溶液的吸光度，计算总黄酮的提取率，结果见图2。从图2可以看出，乙醇体积分数较低时，对原料的提取不够完全，乙醇体积分数太大时就可能使一些脂溶性的杂质溶解增加从而影响了总黄酮的溶出。所以乙醇体积分数为90%时油橄榄叶片中总黄酮的提取率最大。因此在保证原料的有效利用，经济价值最佳的情况下，生产提取油橄榄叶片中的总黄酮应该选择90%的乙醇为提取溶剂。

2.1.2 温度对总黄酮提取率的影响 用90%乙醇，料液比1∶13，分别在40、50、60、70、80 ℃的条件下水浴加热回流2 h，测定总黄酮的提取率，结果见图3。从图3可以看出，总黄酮的提取率随温度的升高而逐渐增加，提取温度为70 ℃时提取率最大，70 ℃以后又逐渐降低。在40～70 ℃的范围内随着温度升高，分子运动加快，溶质分子与溶剂分子能够充分接触，使总黄酮能够更容易溶解到溶剂中，超过70 ℃后随着热效应的影响，杂质的溶出量开始增加，一些活性成分也会被破坏，所以综合考虑提取温度宜在70 ℃左右。

2.1.3 料液比对总黄酮提取率的影响 用90%乙醇，分别在料液比为1∶13、1∶15、1∶17、1∶19、1∶21时的条件下进行提取试验，温度控制在70 ℃，水浴加热回流2 h，测定总黄酮的提取率，结果见图4。从图4可以看出，随着料液比的降低总黄酮的提取率先增大后降低，在1∶19时提取率最大，而在1∶19至1∶21时提取率呈现降低趋势。当料液比达到一定比例时，总黄酮已基本溶出，再降低料液比，可能由于总黄酮被反应消耗了，反而降低总黄酮的提取效果。同时随着溶剂量的增加，回收试剂的能耗就越高，不利于提高经济效益。因此，在确保提取效果的前提下，应降低回收试剂消耗的成本，所以选择料液比为1∶17。

2.1.4 回流时间对总黄酮提取率的影响 用90%的乙醇，料液比1∶19，提取温度70 ℃的条件下，分别回流1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h 后，测定总黄酮的提取率，结果见图5。由图5可以看出，随着提取时间的延长，总黄酮的提取率先上升后下降。在1.0～2.0 h时范围内上升趋势明显，2.0 h达到最大值，2.0 h之后只有较小的下降趋势。刚开始时由于时间较短总黄酮与溶剂还没充分反应，在2.0 h时提取率最大，时间超过2.0 h，溶剂挥发导致乙醇体积分数降低或者杂质溶解增加影响了总黄酮的溶出，使总黄酮的提取率有所下降。

2.2 正交试验结果

在单因素试验的基础上，选用L9（34）正交试验设计以确定最佳提取条件，根据表1进行正交试验，得正交试验结果如表2。从表2可知，乙醇体积分数、提取温度、料液比和回流时间这4个因素对总黄酮提取率影响主次顺序为乙醇体积分数、料液比、提取温度、回流时间，根据正交试验得出最佳提取条件为乙醇体积分数90%，料液比1∶19，提取温度60 ℃，回流时间1.5 h。根据最佳条件得到油橄榄叶片的总黄酮含量为22.8 mg/g，最佳提取率为2.280%。

3 结论

通过以上初步试验可以得出，单因素最佳条件为乙醇体积分数90%，提取温度70 ℃，料液比1∶17，回流时间2.0 h。在单因素最佳基础上进行的正交试验得出最佳提取工艺即乙醇体积分数90%，提取温度60 ℃，料液比1∶19，回流时间1.5 h。根据最佳提取工艺试验得出油橄榄叶片中总黄酮含量为22.8 mg/g，油橄榄叶片中活性物质总黄酮的最佳提取率达到2.280%。该方法简单易行，对于油橄榄叶片的利用打下了一定的基础。

参考文献：

[1] 白满英，张金诚，崔育京.橄榄油的开发应用[J].粮油食品科技，2003，11（2）：31-33，45.

[2] HEIMLER D，PIERONI A，TATTINI M，et al.Determination of flavonoids，flavonoid glycosides and bliflavonoids in Olea europaea L.leaves[J]. Chromatographia，1992，33（7-8）：369-373.

[3] 朱静平.油橄榄叶中活性成份初步分析[J].湖北农业科学，2012， 51（15）：3315-3317.

[4] 许 晖，孔兰萍，张 斌，等.花生壳总黄酮乙醇提取工艺研究[J].食品工业科技，2007，28（8）：135-139.

[5] 陈育平.正交分析法筛选陈皮总黄酮的提取溶剂[J].大家健康（学术版），2012（12）：4-6.

[6] 王占彬，李元晓，朱世康，等.刺槐种子中黄酮类化合物的提取工艺研究[J].饲料工业，2009，30（14）：47-50.

[7] 郑国华，许 洁，李能发.不同提取方法对霉茶中总黄酮含量的影响[J].湖北中医学院学报，2006，8（1）：35-36.

[8] 王 凯.宁夏沙枣中总黄酮的提取工艺研究[J].安徽农业科学，2011，39（14）：8343-8344，8347.

[9] 白喜婷，朱文学，罗 磊，等.杜仲雄花茶中黄酮类化合物的提取工艺研究[J].食品研究与开发，2008，29（11）：96-100.

[10] 郑媛媛，李 辰，封士兰，等.油橄榄叶中总黄酮含量测定方法探讨[J].光谱学与光谱分析，2011，31（2）：547-550.

1.3.5 总黄酮测定方法 量取样品溶液2.5 mL置于25 mL容量瓶中，按照“1.3.4”的方法测定吸光度。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 乙醇体积分数对总黄酮提取率的影响 称取10 g样品粉末，分别用 60%、70%、80%、90%、95%乙醇溶液为溶剂，然后在提取温度80 ℃，料液比（m/v，g∶mL，下同）1∶13的条件下，水浴加热回流2 h，真空抽滤两次，常压蒸馏回收乙醇，浓缩液用去离子水定容至250 mL，静置沉淀24 h，取上清液10 mL，用60%乙醇定容至100 mL，即样品溶液。取样品溶液2.5 mL按照“1.3.4”的方法测定样品溶液的吸光度，计算总黄酮的提取率，结果见图2。从图2可以看出，乙醇体积分数较低时，对原料的提取不够完全，乙醇体积分数太大时就可能使一些脂溶性的杂质溶解增加从而影响了总黄酮的溶出。所以乙醇体积分数为90%时油橄榄叶片中总黄酮的提取率最大。因此在保证原料的有效利用，经济价值最佳的情况下，生产提取油橄榄叶片中的总黄酮应该选择90%的乙醇为提取溶剂。

2.1.2 温度对总黄酮提取率的影响 用90%乙醇，料液比1∶13，分别在40、50、60、70、80 ℃的条件下水浴加热回流2 h，测定总黄酮的提取率，结果见图3。从图3可以看出，总黄酮的提取率随温度的升高而逐渐增加，提取温度为70 ℃时提取率最大，70 ℃以后又逐渐降低。在40～70 ℃的范围内随着温度升高，分子运动加快，溶质分子与溶剂分子能够充分接触，使总黄酮能够更容易溶解到溶剂中，超过70 ℃后随着热效应的影响，杂质的溶出量开始增加，一些活性成分也会被破坏，所以综合考虑提取温度宜在70 ℃左右。

2.1.3 料液比对总黄酮提取率的影响 用90%乙醇，分别在料液比为1∶13、1∶15、1∶17、1∶19、1∶21时的条件下进行提取试验，温度控制在70 ℃，水浴加热回流2 h，测定总黄酮的提取率，结果见图4。从图4可以看出，随着料液比的降低总黄酮的提取率先增大后降低，在1∶19时提取率最大，而在1∶19至1∶21时提取率呈现降低趋势。当料液比达到一定比例时，总黄酮已基本溶出，再降低料液比，可能由于总黄酮被反应消耗了，反而降低总黄酮的提取效果。同时随着溶剂量的增加，回收试剂的能耗就越高，不利于提高经济效益。因此，在确保提取效果的前提下，应降低回收试剂消耗的成本，所以选择料液比为1∶17。

2.1.4 回流时间对总黄酮提取率的影响 用90%的乙醇，料液比1∶19，提取温度70 ℃的条件下，分别回流1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h 后，测定总黄酮的提取率，结果见图5。由图5可以看出，随着提取时间的延长，总黄酮的提取率先上升后下降。在1.0～2.0 h时范围内上升趋势明显，2.0 h达到最大值，2.0 h之后只有较小的下降趋势。刚开始时由于时间较短总黄酮与溶剂还没充分反应，在2.0 h时提取率最大，时间超过2.0 h，溶剂挥发导致乙醇体积分数降低或者杂质溶解增加影响了总黄酮的溶出，使总黄酮的提取率有所下降。

2.2 正交试验结果

在单因素试验的基础上，选用L9（34）正交试验设计以确定最佳提取条件，根据表1进行正交试验，得正交试验结果如表2。从表2可知，乙醇体积分数、提取温度、料液比和回流时间这4个因素对总黄酮提取率影响主次顺序为乙醇体积分数、料液比、提取温度、回流时间，根据正交试验得出最佳提取条件为乙醇体积分数90%，料液比1∶19，提取温度60 ℃，回流时间1.5 h。根据最佳条件得到油橄榄叶片的总黄酮含量为22.8 mg/g，最佳提取率为2.280%。

3 结论

通过以上初步试验可以得出，单因素最佳条件为乙醇体积分数90%，提取温度70 ℃，料液比1∶17，回流时间2.0 h。在单因素最佳基础上进行的正交试验得出最佳提取工艺即乙醇体积分数90%，提取温度60 ℃，料液比1∶19，回流时间1.5 h。根据最佳提取工艺试验得出油橄榄叶片中总黄酮含量为22.8 mg/g，油橄榄叶片中活性物质总黄酮的最佳提取率达到2.280%。该方法简单易行，对于油橄榄叶片的利用打下了一定的基础。

参考文献：

[1] 白满英，张金诚，崔育京.橄榄油的开发应用[J].粮油食品科技，2003，11（2）：31-33，45.

[2] HEIMLER D，PIERONI A，TATTINI M，et al.Determination of flavonoids，flavonoid glycosides and bliflavonoids in Olea europaea L.leaves[J]. Chromatographia，1992，33（7-8）：369-373.

[3] 朱静平.油橄榄叶中活性成份初步分析[J].湖北农业科学，2012， 51（15）：3315-3317.

[4] 许 晖，孔兰萍，张 斌，等.花生壳总黄酮乙醇提取工艺研究[J].食品工业科技，2007，28（8）：135-139.

[5] 陈育平.正交分析法筛选陈皮总黄酮的提取溶剂[J].大家健康（学术版），2012（12）：4-6.

[6] 王占彬，李元晓，朱世康，等.刺槐种子中黄酮类化合物的提取工艺研究[J].饲料工业，2009，30（14）：47-50.

[7] 郑国华，许 洁，李能发.不同提取方法对霉茶中总黄酮含量的影响[J].湖北中医学院学报，2006，8（1）：35-36.

[8] 王 凯.宁夏沙枣中总黄酮的提取工艺研究[J].安徽农业科学，2011，39（14）：8343-8344，8347.

[9] 白喜婷，朱文学，罗 磊，等.杜仲雄花茶中黄酮类化合物的提取工艺研究[J].食品研究与开发，2008，29（11）：96-100.

[10] 郑媛媛，李 辰，封士兰，等.油橄榄叶中总黄酮含量测定方法探讨[J].光谱学与光谱分析，2011，31（2）：547-550.

1.3.5 总黄酮测定方法 量取样品溶液2.5 mL置于25 mL容量瓶中，按照“1.3.4”的方法测定吸光度。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 乙醇体积分数对总黄酮提取率的影响 称取10 g样品粉末，分别用 60%、70%、80%、90%、95%乙醇溶液为溶剂，然后在提取温度80 ℃，料液比（m/v，g∶mL，下同）1∶13的条件下，水浴加热回流2 h，真空抽滤两次，常压蒸馏回收乙醇，浓缩液用去离子水定容至250 mL，静置沉淀24 h，取上清液10 mL，用60%乙醇定容至100 mL，即样品溶液。取样品溶液2.5 mL按照“1.3.4”的方法测定样品溶液的吸光度，计算总黄酮的提取率，结果见图2。从图2可以看出，乙醇体积分数较低时，对原料的提取不够完全，乙醇体积分数太大时就可能使一些脂溶性的杂质溶解增加从而影响了总黄酮的溶出。所以乙醇体积分数为90%时油橄榄叶片中总黄酮的提取率最大。因此在保证原料的有效利用，经济价值最佳的情况下，生产提取油橄榄叶片中的总黄酮应该选择90%的乙醇为提取溶剂。

2.1.2 温度对总黄酮提取率的影响 用90%乙醇，料液比1∶13，分别在40、50、60、70、80 ℃的条件下水浴加热回流2 h，测定总黄酮的提取率，结果见图3。从图3可以看出，总黄酮的提取率随温度的升高而逐渐增加，提取温度为70 ℃时提取率最大，70 ℃以后又逐渐降低。在40～70 ℃的范围内随着温度升高，分子运动加快，溶质分子与溶剂分子能够充分接触，使总黄酮能够更容易溶解到溶剂中，超过70 ℃后随着热效应的影响，杂质的溶出量开始增加，一些活性成分也会被破坏，所以综合考虑提取温度宜在70 ℃左右。

2.1.3 料液比对总黄酮提取率的影响 用90%乙醇，分别在料液比为1∶13、1∶15、1∶17、1∶19、1∶21时的条件下进行提取试验，温度控制在70 ℃，水浴加热回流2 h，测定总黄酮的提取率，结果见图4。从图4可以看出，随着料液比的降低总黄酮的提取率先增大后降低，在1∶19时提取率最大，而在1∶19至1∶21时提取率呈现降低趋势。当料液比达到一定比例时，总黄酮已基本溶出，再降低料液比，可能由于总黄酮被反应消耗了，反而降低总黄酮的提取效果。同时随着溶剂量的增加，回收试剂的能耗就越高，不利于提高经济效益。因此，在确保提取效果的前提下，应降低回收试剂消耗的成本，所以选择料液比为1∶17。

2.1.4 回流时间对总黄酮提取率的影响 用90%的乙醇，料液比1∶19，提取温度70 ℃的条件下，分别回流1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h 后，测定总黄酮的提取率，结果见图5。由图5可以看出，随着提取时间的延长，总黄酮的提取率先上升后下降。在1.0～2.0 h时范围内上升趋势明显，2.0 h达到最大值，2.0 h之后只有较小的下降趋势。刚开始时由于时间较短总黄酮与溶剂还没充分反应，在2.0 h时提取率最大，时间超过2.0 h，溶剂挥发导致乙醇体积分数降低或者杂质溶解增加影响了总黄酮的溶出，使总黄酮的提取率有所下降。

2.2 正交试验结果

在单因素试验的基础上，选用L9（34）正交试验设计以确定最佳提取条件，根据表1进行正交试验，得正交试验结果如表2。从表2可知，乙醇体积分数、提取温度、料液比和回流时间这4个因素对总黄酮提取率影响主次顺序为乙醇体积分数、料液比、提取温度、回流时间，根据正交试验得出最佳提取条件为乙醇体积分数90%，料液比1∶19，提取温度60 ℃，回流时间1.5 h。根据最佳条件得到油橄榄叶片的总黄酮含量为22.8 mg/g，最佳提取率为2.280%。

3 结论

通过以上初步试验可以得出，单因素最佳条件为乙醇体积分数90%，提取温度70 ℃，料液比1∶17，回流时间2.0 h。在单因素最佳基础上进行的正交试验得出最佳提取工艺即乙醇体积分数90%，提取温度60 ℃，料液比1∶19，回流时间1.5 h。根据最佳提取工艺试验得出油橄榄叶片中总黄酮含量为22.8 mg/g，油橄榄叶片中活性物质总黄酮的最佳提取率达到2.280%。该方法简单易行，对于油橄榄叶片的利用打下了一定的基础。

参考文献：

[1] 白满英，张金诚，崔育京.橄榄油的开发应用[J].粮油食品科技，2003，11（2）：31-33，45.

[2] HEIMLER D，PIERONI A，TATTINI M，et al.Determination of flavonoids，flavonoid glycosides and bliflavonoids in Olea europaea L.leaves[J]. Chromatographia，1992，33（7-8）：369-373.

[3] 朱静平.油橄榄叶中活性成份初步分析[J].湖北农业科学，2012， 51（15）：3315-3317.

[4] 许 晖，孔兰萍，张 斌，等.花生壳总黄酮乙醇提取工艺研究[J].食品工业科技，2007，28（8）：135-139.

[5] 陈育平.正交分析法筛选陈皮总黄酮的提取溶剂[J].大家健康（学术版），2012（12）：4-6.

[6] 王占彬，李元晓，朱世康，等.刺槐种子中黄酮类化合物的提取工艺研究[J].饲料工业，2009，30（14）：47-50.

[7] 郑国华，许 洁，李能发.不同提取方法对霉茶中总黄酮含量的影响[J].湖北中医学院学报，2006，8（1）：35-36.

[8] 王 凯.宁夏沙枣中总黄酮的提取工艺研究[J].安徽农业科学，2011，39（14）：8343-8344，8347.

[9] 白喜婷，朱文学，罗 磊，等.杜仲雄花茶中黄酮类化合物的提取工艺研究[J].食品研究与开发，2008，29（11）：96-100.

[10] 郑媛媛，李 辰，封士兰，等.油橄榄叶中总黄酮含量测定方法探讨[J].光谱学与光谱分析，2011，31（2）：547-550.