鸭ApoVLDL-Ⅱ基因第1内含子多态性及其遗传效应

林秋娟, 任播扬, 何桂娟, 黄守婷, 王景伟, 肖天放

(1.福建农林大学动物科学学院，福建 福州 350002；2.福建省畜牧总站，福建 福州 350001)

鸭ApoVLDL-Ⅱ基因第1内含子多态性及其遗传效应

林秋娟1, 任播扬2, 何桂娟1, 黄守婷1, 王景伟1, 肖天放1

(1.福建农林大学动物科学学院，福建 福州 350002；2.福建省畜牧总站，福建 福州 350001)

以褐色菜鸭为材料，对其ApoVLDL-Ⅱ基因第1内含子进行PCR-SSCP检测，分析其多态性及遗传效应.结果表明，在ApoVLDL-Ⅱ基因第1内含子检测到多态性，存在BB、Bb和bb 3种基因型，序列比对发现存在T374C、C379T和T390G 3个单核苷酸多态位点，该位点属中度多态，并处于Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05).关联分析显示，bb基因型个体的蛋重极显著高于BB型(P<0.01)，bb基因型个体的蛋白重显著高于BB型(P<0.05).推测该片段的多态位点可能对褐色菜鸭蛋重和蛋白重有一定的影响.

ApoVLDL-Ⅱ基因; PCR-SSCP; 多态性; 褐色菜鸭

载脂蛋白极低密度脂蛋白Ⅱ(very low density lipoprotein-Ⅱ, ApoVLDL-Ⅱ)是密度非常低的磷脂载体蛋白[1]，在血液中以极低密度脂蛋白(very low density lipoprotein, VLDL)的形式传输中性脂质[2-3].禽类和哺乳动物的ApoVLDL-Ⅱ基因均由4个外显子和3个内含子组成[4]，全长1378 bp，含2个TATA框、1个鸡卵清蛋白上游启动子元件(COUP)和2个雌激素受体反应元件(ERE)[5-6].ApoVLDL-Ⅱ基因在雄性动物中通常处于休眠状态，但通过雌激素的激活可在肝脏特异表达[7-8].在蛋禽产蛋期间，肝脏中ApoVLDL-Ⅱ基因mRNA的表达明显增多，促进了VLDL的分泌，间接影响到卵母细胞的发育，进而影响产蛋[9-10]；同时，ApoVLDL-Ⅱ基因的表达也保护VLDL不被脂蛋白脂肪酶水解，使其最终可以被输送到卵黄，为胚胎的发育提供营养[11-14].因此，ApoVLDL-Ⅱ基因在脂代谢和禽类的繁殖中起着重要的作用.

近年来，有关鸡ApoVLDL-Ⅱ基因多态性与生产性能之间的关联分析较多，而对鸭ApoVLDL-Ⅱ基因的相关分析报道较少.因此，本试验采用PCR-SSCP技术分析了褐色菜鸭ApoVLDL-Ⅱ基因的多态性，并比较个体褐色菜鸭各基因型之间生产性能的差异，旨在为今后褐色菜鸭标记辅助选择提供参考依据.

1 材料与方法

1.1 材料

供试的褐色菜鸭由福建省石狮市水禽保种中心提供.对有完整0-16周龄生长体重和300日龄产蛋记录的94羽褐色菜鸭进行翼下静脉采血.血样置于-20 ℃的冰箱中保存备用.

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA的提取 用Ezup柱式基因组DNA抽提试剂盒提取DNA，用1%琼脂糖凝胶电泳检测，于-20 ℃的冰箱中保存备用.

1.2.2 PCR扩增 根据NCBI数据库中绿头鸭ApoVLDL-Ⅱ基因(登录号：GQ180104.1)的全基因序列，设计引物，扩增ApoVLDL-Ⅱ基因第1内含子.引物序列为：上游——5′GGACCTTTGACCCCTCACTATCT3′，下游——5′GCAGCAGTTCCTCAGTTACCA3′.PCR反应体系(25 μL)：6.25 μL 2×PCR-MIX、10 μmol·L-1上下游引物各1 μL、2 μL基因组DNA、14.75 μL ddH2O.PCR反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性45 s，56.4 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，共32个循环；72 ℃再延伸10 min.

1.2.3 PCR产物的SSCP检测 用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物后，将2 μL PCR产物与9 μL变性Buffer混合，于95 ℃变性10 min，迅速取出置冰水混合物中淬火10 min，用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(100 V、12-15 h)检测后银染显色.

1.2.4 测序 经PCR-SSCP分析后，挑选特异性较好的各纯合子基因型个体PCR产物送上海生工生物工程技术服务有限公司纯化后测序.

1.2.5 数据处理 统计不同基因型个体的数量，计算等位基因频率和基因型频率，采用SAS 9.1程序的GLM过程比较个体褐色菜鸭各基因型之间生产性能的差异.以Yij=μ+Pi+Gj+eij模型为基础进行最小二乘方差分析.其中，Yij为性状的记录值，μ为群体均值，Pi为第i个家系效应，Gj为第j个基因型效应，eij为随机残差效应.

2 结果与分析

2.1 PCR扩增结果

用设计的引物对不同个体褐色菜鸭基因组DNA进行扩增，PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测.凝胶成像结果显示特异性扩增良好，片段大小与目的片段的大小一致(图1)，可直接进行SSCP检测.

图1 ApoVLDL-Ⅱ基因第1内含子PCR扩增结果Fig.1 The amplified PCR product of ApoVLDL-Ⅱ gene intron 1

2.2 SSCP检测结果

对褐色菜鸭ApoVLDL-Ⅱ基因第1内含子PCR产物进行SSCP电泳检测后，银染显色拍照，结果共检测出3种基因型(图2)，定义为BB、Bb和bb，等位基因为B和b.ApoVLDL-Ⅱ基因B座位多态位点分析结果(表1、2)显示：Bb型频率为0.42，为优势基因型；等位基因b频率为0.57，为优势等位基因；从基因型频率来看，呈现“Bb>bb>BB”的趋势.该基因座位的多态信息含量为0.37，属于中度多态.χ2适应性检验结果表明，突变位点处于Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05).

图2 ApoVLDL-Ⅱ基因第1内含子SSCP检测结果Fig.2 Band patters of ApoVLDL-Ⅱ gene intron 1 with SSCP

基因型基因型频率/%N/羽期望值等位基因频率/%BbBB0.2221170.430.57Bb0.423946bb0.363430

表2 ApoVLDL-Ⅱ基因第1内含子多态性分析结果Table 2 Genetic diversity of ApoVLDL-Ⅱ gene intron 1

2.3 测序分析结果

将纯合子为BB和bb基因型的褐色菜鸭ApoVLDL-Ⅱ基因第1内含子进行2次DNA扩增，送至上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序.采用Dnastar和Chromas软件分析测序结果，并与GenBank上绿头鸭的ApoVLDL-Ⅱ基因序列进行比对.结果表明：褐色菜鸭BB基因型的序列与绿头鸭的序列一致，为野生型；bb型为突变型，分别在第374 bp处出现碱基T→C的点突变，定义为T374C；第379 bp处出现碱基C→T的点突变，定义为C379T；第390 bp处出现碱基T→G的点突变，定义为T390G(图3).

图3 BB和bb基因型测峰序列图Fig.3 The sequences of BB, bb genotype

2.4ApoVLDL-Ⅱ基因第1内含子基因型与生产性能的关联性

褐色菜鸭ApoVLDL-Ⅱ基因第1内含子的多态性与各性状指标的最小二乘法分析结果(表3)表明，bb基因型个体的蛋重极显著高于BB型(P<0.01)，bb基因型个体的蛋白重显著高于BB型(P<0.05)，但3种基因型对其他性状无显著影响(P>0.05).

3 讨论

定位数量性状位点对加强性状改良以及促进家禽育种工作具有实际意义，候选基因法能够直接研究候选基因多态位点与目标性状之间的相关性，可进行大规模的群体检测，是常用、有效的定位数量性状位点的方法.近年来，一些研究采用候选基因法探讨了家禽ApoVLDL-Ⅱ基因多态性与生产性能之间的关系.如程金花等[15]以皋黄鸡和安卡肉鸡为研究对象，设计9对引物采用PCR-SSCP技术在鸡ApoVLDL-Ⅱ基因第1内含子检测到3个单核苷酸多态位点，即A2522C、A2705C和C2793T，并发现不同基因型对鸡的肉色、嫩度和pH 3个性状有显著影响；张依裕等[16]采用PCR-SSCP方法在金定鸭ApoVLDL-Ⅱ基因第3内含子检测到3个单核苷酸多态位点，即G47A、G136A和C228T，突变导致AA、AB和BB 3种基因型.其中，A为优势基因，基因多态性显著影响金定鸭的胸肌水分和肌肉剪切力；Hamid et al[17]采用PCR-RFLP方法在伊朗商业肉鸡ApoVLDL-Ⅱ基因第1内含子检测到突变位点，发现该突变位点对伊朗商业肉鸡6周龄的活重、胴体重和胸肌重有显著影响.

表3 ApoVLDL-Ⅱ基因第1内含子不同基因型对褐色菜鸭各性状的影响1)Table 3 The effects of different genotypes of ApoVLDL-Ⅱ gene intron1 on Brown Tsaiya duck traits

1)所测定的蛋品质均为300日龄鸭所产蛋的品质；同列数据后附不同大写字母者表示差异极显著(P<0.01)，附不同小写字母者表示差异显著(P<0.05).

本试验采用PCR-SSCP技术在褐色菜鸭ApoVLDL-Ⅱ基因第1内含子中也检测出多态性，经序列比对发现存在T374C、C379T和T390G 3个单核苷酸多态位点，BB、Bb和bb 3种基因型.χ2检验表明，突变位点处于Hardy-Weinberg平衡状态，表明所选褐色菜鸭群体遗传是随机的，群体中个体的等位基因频率和基因型的分布比例(频率)能够世代维持相对稳定，这可能与保种中心采用家系等量随机保种方式有关.但从群体遗传多态性角度分析，褐色菜鸭该基因座属中度多态，可以进一步加以选择.

关联分析表明，褐色菜鸭ApoVLDL-Ⅱ基因第1内含子bb基因型个体的蛋重极显著高于BB型，bb基因型个体的蛋白重显著高于BB型，表明bb型在蛋重和蛋白重上为优势基因型，推测该片段的多态性位点对蛋重和蛋白重有一定的影响.此外，本试验还对ApoVLDL-Ⅱ基因的不同基因型与300日龄褐色菜鸭的总产蛋数、蛋黄重、蛋壳重、蛋白比率、蛋黄比率、蛋形指数、蛋壳厚度、哈夫单位、色泽级别、开产体重、出生重、4周龄体重和开产日龄等多个性状进行了关联分析，但均不存在显著关系，这可能与分析的样本数不够大，或该位点对它们确实不存在遗传效应有关.蛋品质性状虽受到诸多因素的影响，但本试验发现ApoVLDL-Ⅱ基因对褐色菜鸭的生产性能有一定的影响，这与前人对家禽ApoVLDL-Ⅱ基因的研究结果[15-17]相似，表明ApoVLDL-Ⅱ基因可能是影响褐色菜鸭生产性能的主效基因或者是标记基因，为开展褐色菜鸭的生产标记辅助选择提供理论依据.

[1] PINCHASOV Y S, ELMALIAH S, BEZDIN S. Plasma apolipoproptein VLDL-Ⅱ and egg production in laying hens: establishment of an ELISA Method [J]. Reproductiom Nutrition Development, 1994,34(4):361-369.

[2] SCHBEIDER W J, CARROLL R, SEVERSON D L, et al. Apolipoprotein VLDL-Ⅱ inhibits lipolysis of triglyceride-rich lipoproteins in the laying hen [J]. J Lipid Res, 1990,31(3):507-513.

[3] JOHANNES N, WOLF G J S. Receptor-mediated lipoprotein transport in laying hens [J]. J Nutr, 1991,121(9):1471-1474.

[4] EVA Z, MELINDA K N, FRANCA E, et al. Transgenic mouse model for estrogen-regulated lipoprotein metabolism: studies on apoVLDL-Ⅱ expression in transgenic mice [J]. J Lipid Res, 1995,36(7):1453-1462.

[5] BERKOWITZ E A, EVANS M I. Functional analysis of regulatory regions upstream and in the first intron of the estrogen-responsive chicken very low densityapolipoproteinⅡ gene [J]. J Bid Chem, 1992,267(10):7134-7138.

[6] HACHE R J G, DEELEY R G. Organization sequence and nuclease hypersensitivity of repetitive elements flanking the chickenApoVLDL-Ⅱ gene: extended sequence similarity to elements flanking the chicken vitellogenin gene [J]. Nucleic Acids Research, 1988,16(1):97-113.

[7] TEJADA M L Z, May D. Determination of the DNA-binding specificity of the avian homeodomain protein [J]. DNA Cell BloL, 1999,18:791-804.

[8] YEN C F, JIANG Y N, SHEN T F, et al. Cloning and expression of the genes associated with lipid metabolism in Tsaiya ducks [J]. Poult Sci, 2005,84(1):67-74.

[9] SHU J Y, YEUNSU S, YOUNG M C, et al. Loss of fat with increased adipose triglyceride lipase-mediated lipolysis in adipose tissue during laying stages in quail [J].Lipids, 2013,48(1):13-21.

[10] 陈媛媛.VLDL相关基因的多态性及血清VLDL浓度对肉种母鸡繁殖性能的影响[D].雅安:四川农业大学,2011.

[11] BINDER R C, MACDONALD J B, BURCH C B, et al. Expression of endogenous and transference apolipoprotein-Ⅱ and vitellogenin Ⅱ genes in an estrogen responsive chicken liver cell line [J]. Mol Endocrinol, 1990,4(2):201-208.

[12] ZSIGMOND E, NAKANISHI M K, GHISELLI F E, et al. Transgenic mouse model for estrogen-regulated lipoprotein metabolism: studies on apoVLDL-Ⅱ expression in transgenic mice [J]. J Lipid Res, 1995,36(7):1453-1462.

[13] DOUAIRE M, LANGLOIS P, FLAMANT F, et al.ApoVLDL-Ⅱ gene transcription in immature cockerels without estradiol stimulation [J]. Comp Biochem Physiol B, 1990,97(1):55-58.

[14] HASSAN H M, GUO H C, JIN H C, et al .Single strand conformation polymorphism in intron1 of the chickenApoVLDL-Ⅱ gene, and its relationship with triglyceride and very low density lipoprotein concentrations [J]. Turk J Vet Anim Sci, 2009,33(3):253-255.

[15] 程金花,赵文明,陈清,等.鸡ApoVLDL-Ⅱ基因内含子多态性与肉质关联分析[J].扬州大学学报:农业与生命科学版,2008,29(1):37-40.

[16] 张依裕,徐琪,张海波,等.金定鸭ApoVLDL-Ⅱ基因多态性及其与生产性能的关联分析[J].扬州大学学报:农业与生命科学版,2010,31(4):73-76.

[17] HAMID R S, CYRUS A, NOUR A, et al. Association between single nucleotide polymorphism ofapoVLDL-Ⅱ gene with growth and body composition traits in Iranian commercial broiler line [J]. African Journal of Biotechnology, 2010,9(27):4175-4178.

(责任编辑:施晓棠)

Polymorphism and its genetic effects of duckApoVLDL-Ⅱ gene in intron 1

LIN Qiu-juan1, REN Bo-yang2, HE Gui-juan1, HUANG Shou-ting1, WANG Jing-wei1, XIAO Tian-fang1

(1.College of Animal Science, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, Fujian 350002, China; 2.General Station of Animal Husbandry of Fujian Province, Fuzhou, Fujian 350001, China)

Brown Tsaiya ducks were adopted to analyze the diversity ofApoVLDL-Ⅱ gene intron 1 and its genetic effects using SSCP. The results showed that 3 genotypes (BB, Bb, bb) were identified inApoVLDL-Ⅱ gene intron 1 and 3 single nucleotide polymorphism loci (T374C, C379T, T390G) were detected. These three polymorphism sites belong to medium genetic heterozygosis and achieved in Hardy-Weinberg equilibrium (P>0.05). The individuals of genotype bb in egg weight was significantly heavier than that of genotype BB (P<0.01). And the genotype bb in egg-white weight was heavier than that of genotype BB (P<0.05). Our results indicated that the polymorphisms ofApoVLDL-Ⅱ gene intron 1 might be related with egg weight and egg-white weight.

ApoVLDL-Ⅱ gene; PCR-SSCP; polymorphism; Brown Tsaiya duck

2013-08-03

2013-11-11

福建省重大科技专项(2006NZ003-3)；福建省高等学校科技项目(JA09082).

林秋娟(1987-)，女，硕士.研究方向：动物遗传育种.Email:nuling.123@163.com.通讯作者肖天放(1964-)，男，教授.研究方向：动物遗传育种.Email:tfxiao@163.com.

S813.1

A

1671-5470(2014)04-0403-05