木瓜蛋白酶酶解海蜇脑蛋白工艺的优化

程水明，赵俊仁（等）

摘要：为探讨木瓜蛋白酶酶解海蜇（Rhopilema esculentum）脑蛋白质的最佳工艺，考察了酶解温度、酶用量、固液比、酶解时间、pH对海蜇脑蛋白酶解的影响，通过单因素试验、正交试验优化了工艺参数。结果表明，以酶用量3 000 U/g、pH 5、酶解温度45 ℃、固液比1∶4、酶解2 h为最优酶解参数组合，验证试验得到蛋白质平均水解度为50.11%，表明该优化工艺可行。

关键词：海蜇（Rhopilema esculentum）；蛋白质酶解；木瓜蛋白酶；正交试验

中图分类号：TS254.4 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）07-1649-05

Optimizing Enzymolysis Process of Protein from Jellyfish Brain via Papain Protease

CHENG Shui-ming，ZHAO Jun-ren，WANG Chun，LIANG Jian-tao，ZHANG Qing

（College of Chemistry and Life Science， Guangdong University of Petrochemical Technology， Maoming 525000， Guangdong， China）

Abstract： The optimal technology for enzymolysis of jellyfish（Rhopilema esculentum） brain protein by papain protease was investigated. Effects of enzymolysis temperature， the amount of added enzyme， solid/liquid ratio， enzymolysis time and pH on the enzymolysis of total protein were studied through single factor experiments. Technical parameters were optimized by orthogonal experiments. The results showed that the amount of added enzyme of 3 000 U/g， pH 5， enzymolysis temperature of 45 ℃， solid/liquid ratio of 1∶4 and the amount of added enzyme time for 2 h were the optimal combination of parameters for the enzymolysis. The average degree of hydrolysis obtained from the verification tests was 50.11%， indicating that the optimized results of the orthogonal experiment were workable.

Key words： jellyfish （Rhopilema esculentum）； protein enzymolysis； papain protease； orthogonal experiment

海蜇（Rhopilema esculentum）俗称鲊鱼、海蛇，属于根口水母科（Rhizootomatidae）、海蜇属（Rhopilema）的无缘膜动物，广泛分布在我国南海、东海、黄海和渤海，具有较高的营养价值和药用价值，营养丰富，脂肪含量低，蛋白质和无机盐类等的含量丰富[1-4]，含有不饱和脂肪酸AA、EPA和DHA等[5]。可治疗高血压、支气管炎、淋巴结核等病症。海蜇中所含的活性物质，如功能蛋白、多糖等有很好的保健作用，具有改善皮肤弹性、清除自由基、促进新陈代谢等功效[6-9]。

我国海蜇年产量达70万t[10]，主要作为凉拌食品，加工食用海蜇主要利用其伞部，非食用部分占总体的28%，被用于生产鱼粉供水产和陆地畜禽养殖，但由于加工技术落后，不但产品得率和附加值低，而且严重污染近海水域[11]。非食用部分直接丢弃而未被利用，会造成更为严重的资源浪费和环境污染。海蜇废弃物（脑）蛋白质含量很高（约为脑干重的60%），且生长在特殊环境（高盐、高压、低氧和低光照），其蛋白质氨基酸组成或序列都与陆地生物蛋白质有很大不同。所含生物活性物质可能具有潜在的抗癌、抗病毒和抗衰老等作用，可作为人类治疗疾病药物的理想候选材料[12，13]。如采用生物工程手段对这些废弃物进行酶控水解、膜分级、分离提取、纯化等，精制成肽类产品及鱼用蛋白质，用作食品添加剂、蛋白强化剂或用作研制药物和功能食品的原料，既可解决资源浪费和环境污染问题，又可开发利用海蜇生物蛋白质资源。

本研究主要通过酶解条件控制，探讨木瓜蛋白酶酶解海蜇脑的主要工艺参数，为后续开发和利用海蜇资源，作为药用或功能性食品提供理论依据和技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

海蜇脑采自广东省茂名市电白县博贺港，将新鲜海蜇脑洗净，用组织匀浆机匀浆处理，置于-4 ℃冰箱中保存备用；木瓜蛋白酶（500 000 U/g）购自广西省庞博生物工程有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 酶解试验流程 海蜇脑浆→鼓风干燥→海蜇脑粉→混浆→分离纯化蛋白质（超声波辅助提取）→鼓风干燥→测定总蛋白质含量→木瓜蛋白酶酶解→考马斯亮蓝法测定蛋白质含量→计算水解度。

1.2.2 蛋白质超声波辅助提取总蛋白质 在料液比1∶1（质量比），功率200 W，超声处理时间10 s，其间静置15 s，超声次数为100次，分4组，每组间隔5 min，该过程均在冰浴中进行。料液在12 000 r/min下离心10 min，取上清液置于70 ℃下灭活1 min，移入锥形瓶中，按1∶4（体积比）加去离子水，搅拌均匀，调pH为9，放入4 ℃冰箱中碱液（用NaOH调节反应液pH为6.5）提取12 h。取上清液3 000 r/min离心10 min，将离心后上清液转入干净锥形瓶，调pH为6.5，加饱和硫酸铵（74.5%），搅拌均匀后静置10 min，4 000 r/min离心15 min，得到沉淀物，干燥，称重，采用考马斯亮蓝法测定总蛋白质含量[14，15]。

1.2.3 酶解终点判断 采用双缩脲法进行酶解终点的确定[4]。酶解后取样进行双缩脲反应，根据溶液颜色变化确定海蜇脑蛋白酶解终点。具体操作：在锥形瓶内加入2 mL 0.1 mol/L NaOH溶液，振荡后加入3～4滴CuSO4溶液，振荡、观察；水解液为紫色表明海蜇脑蛋白水解不完全；水解液颜色无变化，则海蜇脑蛋白水解完全，可判断此为水解终点。

1.2.4 水解率计算 利用分光光度法（波长595 nm）测定并绘制牛血清蛋白溶液标准曲线，求出回归方程。根据回归方程计算酶解清液中蛋白质含量，按照下列公式求出水解率[16]。

水解率Q=■×100%

式中， X2为蛋白质总重量（g），X3为酶解后蛋白质重量（g）。

1.3 影响蛋白质酶解的单因素试验

1.3.1 酶用量 取5 g蛋白质粉置于锥形瓶中，按 1∶4（m∶V，下同）加入去离子水，pH为7，酶解温度60 ℃，加入木瓜蛋白酶。酶用量分别为1 000、2 000、3 000、4 000、5 000 U/g，酶解时间4 h。

1.3.2 酶解温度 取5 g蛋白质粉置于锥形瓶中，按1∶4加入去离子水，在pH为7，酶解温度为45、50、55、60、65 ℃，酶用量为4 000 U/g的条件下酶解4 h。

1.3.3 pH 取5 g蛋白质粉置于锥形瓶中，按1∶4加入去离子水， 调节pH为5、6、7、8、9， 酶解温度60 ℃ ，酶解时间4 h，酶用量4 000 U/g的条件下酶解。

1.3.4 酶解时间 取5 g蛋白质粉置于锥形瓶中，按照1∶4加入去离子水，pH为7，酶解温度60 ℃，酶用量4 000 U/g，酶解时间为2、3、4、5、6 h的条件下酶解。

1.3.5 固液比 在pH为7，酶解温度60 ℃，酶解时间4 h，酶用量4 000 U/g， 固液比分别为1∶3、 1∶4、1∶5、 1∶6、 1∶7的条件下进行酶解。

以上各单因素试验酶解结束后用70 ℃热水1 min灭活酶，冷却至室温，取样测定蛋白质含量并计算水解率。

1.4 正交试验

在单因素试验的基础上，选取影响酶解的4个因素，加酶用量、pH、酶解温度和酶解时间。以每因素4个水平，采用L16（44）正交试验设计对海蜇脑蛋白进行酶解试验。正交试验因素和水平见表1。

试验结果采用SPSS软件进行处理，选出最佳的酶解条件。对最佳的酶解条件进行5次验证试验，计算水解率，取平均值。

2 结果与分析

2.1 酶用量对海蜇脑蛋白质水解率的影响

图1结果表明，随着木瓜蛋白酶用量的增加，海蜇脑蛋白质水解率从31.6%上升到48.5%，在木瓜蛋白酶酶用量在2 000～3 000 U/g时，海蜇脑蛋白质水解率上升幅度较大；当酶用量大于3 000 U/g后，水解率变化幅度较小。当酶用量较小时，主要为酶控反应；当酶用量过高时，由于酶本身的相互水解作用加强，会阻碍酶对底物的水解。因此，虽然酶用量为5 000 U/g时，海蜇脑蛋白质水解率达到最大值，但从成本考虑，以添加酶用量3 000 U/g为宜。

2.2 pH对海蜇脑蛋白质水解率的影响

从图2可以看出，当pH从5增加到6时，海蜇脑蛋白质水解率从 28.0%上升到37.8%，在pH为6时达到最大值；当pH继续增加，水解率则有所下降。这可能是由于酶的催化活性部分与海蜇脑蛋白质本身可解离基团充分解离，使酶的活性中心与蛋白质底物充分结合，将底物最大程度地转化为水解产物，使水解率达到最大。

2.3 酶解温度对海蜇脑蛋白质水解率的影响

由图3可知，随着酶解温度从45 ℃增加到50 ℃，海蜇脑蛋白质水解率从21.4%上升到30.1%，在酶解温度为50 ℃时，水解率达最大值；随着温度的继续增加，海蜇脑蛋白质水解率则不断下降，说明超过50 ℃后，由于温度过高，引起木瓜蛋白酶受热变性，使其活性开始减弱，水解率下降。因此，酶解温度选择50 ℃为宜。

2.4 酶解时间对海蜇脑蛋白质水解率的影响

图4结果表明，随着酶解时间的增加，木瓜蛋白酶对海蜇脑蛋白质水解率逐渐升高，水解率在3～4 h时增幅较大； 4 h后， 水解率增加幅度较小， 可能是随时间延长， 酶活力逐渐下降；在酶解时间为6 h时， 水解率达到最大值，但从成本及产业化考虑， 选择酶解时间4 h为宜。

2.5 固液比对海蜇脑蛋白质水解率的影响

由图5可知，当固液比从1∶3转变为1∶4时，海蜇脑蛋白质水解率增加，在固液比为1∶4时达到最大值，之后呈下降趋势。这可能是因为随着固液比的降低，反应体系的水分逐渐增加，从而降低了反应产物的浓度，减少了产物对酶促反应的抑制作用。但由于水解率升降范围较小，表明固液比对水解率的影响不大。

2.6 正交试验结果

为确定木瓜蛋白酶酶解海蜇脑蛋白质的最佳工艺条件，在单因素试验基础上，以蛋白质水解率为考察指标进行正交试验。正交试验结果见表2。

从极差R可知，酶用量对海蜇脑蛋白质水解率的影响最大，其次是酶解pH、酶解温度、酶解时间，通过比较得出酶解海蜇脑蛋白质的最优组合为A3B1C2D1，即酶用量为3 000 U/g、pH为5、酶解温度50 ℃、酶解时间2 h。在此工艺条件下，酶解海蜇脑蛋白质水解率为53.76%。

采用SPSS软件对正交试验结果进行方差分析，结果见表3。从表3可以看出，在本试验中，酶用量和pH对海蜇脑蛋白质水解率影响均达到显著水平，而酶解温度和酶解时间在本试验条件下对水解率的影响均不显著。根据F值的大小，4个因素对水解率影响的主次顺序为：酶用量>pH>酶解温度>酶解时间，这与极差分析的结果一致。本试验的最佳工艺组合为A3B1C2D1，在该试验条件下，水解率为53.76%。但考虑到酶解温度和酶解时间对水解率的影响均不显著，故从节省时间、能源及操作方便性等角度出发，可选择A3B1C1D1为水解条件，在此条件下对海蜇脑蛋白质进行酶解，水解率为50.11%。

2.7 验证试验结果

为了验证正交试验结果的准确性，对正交试验分析得出的最优工艺进行了5次平行验证试验，水解率分别为51.76%、56.17%、53.23%、49.58%、53.76%，平均值为52.90%，均大于正交试验中得到的水解率。说明该最佳工艺条件是合理的、可靠的。

3 结论与讨论

通过单因素试验和正交设计试验，确定木瓜蛋白酶酶解海蜇脑蛋白质的最佳条件为酶用量3 000 U/g、pH为5、酶解温度为45 ℃、酶解时间2 h，固液比为1∶4，在此条件下水解海蜇脑蛋白质，水解率可达50.11%。

本研究在蛋白质提取过程中使用了超声波辅助提取法，可有效提高海蜇脑蛋白质提取效率，缩短提取时间，节约成本。超声波能将蛋白质粉碎、液化，减少蛋白质的变性沉淀，得到优质的蛋白质[17]，安全可靠，对营养价值影响较小[18]，但在提取过程中产生的高温会使小部分蛋白质变性[19]，因此在使用超声提取法过程中应注意超声处理的时间与次数。

水解率可间接反映肽得率大小。本试验结果表明，采用木瓜蛋白酶酶解海蜇脑蛋白质可以得到较高的水解率，即海蜇脑蛋白质所得到的肽率相对较高。若要实现工业化生产，就必须考虑海蜇脑蛋白质和木瓜蛋白酶的高效利用问题，如海蜇脑蛋白质的循环利用，如何进一步利用未被酶解的海蜇脑蛋白质；应用酶的固定化技术，保持酶的催化活性，提高分子结构的稳定性，延长酶的使用期和保管期，能与反应物和产物分开，有效地控制生产过程，并能在生产中反复连续使用。

参考文献：

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2.7 验证试验结果

为了验证正交试验结果的准确性，对正交试验分析得出的最优工艺进行了5次平行验证试验，水解率分别为51.76%、56.17%、53.23%、49.58%、53.76%，平均值为52.90%，均大于正交试验中得到的水解率。说明该最佳工艺条件是合理的、可靠的。

3 结论与讨论

通过单因素试验和正交设计试验，确定木瓜蛋白酶酶解海蜇脑蛋白质的最佳条件为酶用量3 000 U/g、pH为5、酶解温度为45 ℃、酶解时间2 h，固液比为1∶4，在此条件下水解海蜇脑蛋白质，水解率可达50.11%。

本研究在蛋白质提取过程中使用了超声波辅助提取法，可有效提高海蜇脑蛋白质提取效率，缩短提取时间，节约成本。超声波能将蛋白质粉碎、液化，减少蛋白质的变性沉淀，得到优质的蛋白质[17]，安全可靠，对营养价值影响较小[18]，但在提取过程中产生的高温会使小部分蛋白质变性[19]，因此在使用超声提取法过程中应注意超声处理的时间与次数。

水解率可间接反映肽得率大小。本试验结果表明，采用木瓜蛋白酶酶解海蜇脑蛋白质可以得到较高的水解率，即海蜇脑蛋白质所得到的肽率相对较高。若要实现工业化生产，就必须考虑海蜇脑蛋白质和木瓜蛋白酶的高效利用问题，如海蜇脑蛋白质的循环利用，如何进一步利用未被酶解的海蜇脑蛋白质；应用酶的固定化技术，保持酶的催化活性，提高分子结构的稳定性，延长酶的使用期和保管期，能与反应物和产物分开，有效地控制生产过程，并能在生产中反复连续使用。

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2.7 验证试验结果

为了验证正交试验结果的准确性，对正交试验分析得出的最优工艺进行了5次平行验证试验，水解率分别为51.76%、56.17%、53.23%、49.58%、53.76%，平均值为52.90%，均大于正交试验中得到的水解率。说明该最佳工艺条件是合理的、可靠的。

3 结论与讨论

通过单因素试验和正交设计试验，确定木瓜蛋白酶酶解海蜇脑蛋白质的最佳条件为酶用量3 000 U/g、pH为5、酶解温度为45 ℃、酶解时间2 h，固液比为1∶4，在此条件下水解海蜇脑蛋白质，水解率可达50.11%。

本研究在蛋白质提取过程中使用了超声波辅助提取法，可有效提高海蜇脑蛋白质提取效率，缩短提取时间，节约成本。超声波能将蛋白质粉碎、液化，减少蛋白质的变性沉淀，得到优质的蛋白质[17]，安全可靠，对营养价值影响较小[18]，但在提取过程中产生的高温会使小部分蛋白质变性[19]，因此在使用超声提取法过程中应注意超声处理的时间与次数。

水解率可间接反映肽得率大小。本试验结果表明，采用木瓜蛋白酶酶解海蜇脑蛋白质可以得到较高的水解率，即海蜇脑蛋白质所得到的肽率相对较高。若要实现工业化生产，就必须考虑海蜇脑蛋白质和木瓜蛋白酶的高效利用问题，如海蜇脑蛋白质的循环利用，如何进一步利用未被酶解的海蜇脑蛋白质；应用酶的固定化技术，保持酶的催化活性，提高分子结构的稳定性，延长酶的使用期和保管期，能与反应物和产物分开，有效地控制生产过程，并能在生产中反复连续使用。

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