拮抗农业致病菌放线菌G5发酵条件的优化

刘杨，王勇（等）

摘要：微生物的发酵过程十分复杂，培养基配方的组成以及培养条件的变化都会对菌体的代谢造成很大的影响。为了使抗生素的产量达到最大化，试验运用了Plackett-Burman试验设计、最陡爬坡试验、Box-Behnken试验设计对放线菌（Actinomycetes）G5进行了发酵条件优化。利用Plackett-Burman试验设计对影响放线菌G5发酵的诸多相关因素进行评估并筛选出3个主要因素，即碳源含量、培养温度和培养时间；之后根据3个主要因素的作用大小和方向进行了最陡爬坡试验；最后运用Box-Behnken试验设计确定最优值，得出其最优培养条件为淀粉含量21.66 g/L、培养温度27.70 ℃、培养时间7.75 d。在此条件下，抗生素对苹果轮纹病菌的抑菌圈直径为23.00 mm，与模型预测值基本一致。

关键词：放线菌（Actinomycetes）G5；Plackett-Burman试验设计；最陡爬坡试验；Box-Behnken试验设计；发酵条件优化

中图分类号：TQ458 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）07-1634-03

Optimization of Fermentation Conditions for Actinomycetes G5

LIU Yang， WANG Yong， KANG Jing-qin， ZHANG Liang

（University of Science and Technology Liaoning， Anshan 114044， Liaoning，China）

Abstract：Microbial fermentation process were very complex due to effects of culture medium composition and culture conditions on cell metabolism. Fermentation conditions for actinomycetes G5 were optimized with Plackett-Burman experimental design， steepest ascent experiments， and Box-Behnken design. Three main factors affecting the fermentation of actinomycetes G5 screened by Plackeet-Burman design were carbon content， temperature and culture days. Then the steepest ascent experiments were conducted based on the action degree and direction of the three main factors. The optimal conditions were finally determined by Box-Behnken design. The results showed that the optimal fermentation condition for actinomycetes G5 were starch content of 21.66 g/L， culture temperature of 27.70 ℃ and culture days of 7.75 d. Under these conditions， the bacterial inhibition diameter of the acquired antibiotics against physalospora piricola was 23.00 mm， equal to the model prediction.

Key words： Actinomycetes G5； Plackett-Burman design； steepest ascent experiment； Box-Behnken； optimization

放线菌（Actinomycetes）G5的次级代谢产物抗生素对苹果轮纹病菌（Physalospora piricola）、黄瓜炭疽病菌（Colletotrichum orbiculare）等多种农业致病菌有较强的抑制作用[1]。在对放线菌G5的发酵过程中，液体培养基的配方和培养条件对抗生素的产量都有明显的影响[2]，因而发酵条件的优化工作就显得尤为重要。本试验运用响应面法对放线菌G5的发酵条件进行全面优化，以确保抗生素的产量达到最大。响应面法是利用简洁精确的试验设计，采用多元二次回归方程拟合因素和响应值之间的函数关系，通过对回归方程的分析来寻求最优条件参数，解决多变量问题的统计方法[3]。本试验运用响应面法中的Plackett-Burman设计、最陡爬坡试验、Box-Behnken设计来优化放线菌G5的培养基配方和培养条件。应用Design-Expert.V.8.0.6软件对试验数据进行处理，获得了回归方程，效果显著[4]。

1 试验材料与方法

1.1 供试材料

放线菌G5及苹果轮纹病菌均为辽宁科技大学微生物实验室保藏菌种。

1.2 试验方法

1.2.1 Plackett-Burman试验设计 本试验考察高氏1号培养基中的碳源（淀粉）、氮源（KNO3）以及培养条件中的培养温度、培养时间、接种量和装液量对发酵液中抗生素产量的影响，各因素分别取“-1”、“1”两个水平，具体见表1。以抗生素对苹果轮纹病菌的抑菌圈大小（直径，mm）作为检测指标（滤纸片法）[5]。最终得出对抗生素产量影响最大的3个主要因素[6]。

1.2.2 最陡爬坡试验 根据“1.2.1”试验的结果确定最陡爬坡试验的爬坡方向和各因素效应值的大小，确定变化步长，快速逼近最优区域[7]。

1.2.3 Box-Behnken试验设计 对试验数据采用多元二次方程来拟合因素和响应面值之间的函数关系，通过对回归方程的分析来寻求最优提取条件，确定最优值。

2 结果与分析

2.1 Plackett-Burman试验设计结果

表2为Design-Expert.V.8.0.6软件设计的12组试验，再利用滤纸片抑菌法得到响应值D。用SPSS软件处理表2中的数据，得到各因素的主要效应及其显著性（表3）。

当P<0.05时影响显著，P<0.01时影响极显著。由表3可知，培养温度和培养时间对发酵液中抗生素产量的影响为显著，淀粉含量对发酵液中抗生素产量的影响为极显著。所以可以将对发酵液中抗生素产量影响不显著的因素控制在一个较好的水平上，选择3个影响显著的因素做进一步的响应面试验。

2.2 最陡爬坡试验结果

由Plackett-Burman试验可知，放线菌G5发酵条件中淀粉含量、培养温度、培养时间3个因素对抗生素的产量有显著影响，其中淀粉含量和培养时间有显著的正效应，应增加；培养温度有显著的负效应，应减少。根据3个因素效应大小的比例设定其变化方向及步长进行试验[4]。

由表4可知，第3组的试验效果最好，所以以第3组试验各因素的水平作为中心点。

2.3 Box-Behnken试验设计及结果

根据Plackett-Burman试验和最陡爬坡试验来确定Box-Behnken试验的因素和水平。具体见表5。

根据Box-Behnken的中心组合设计原理，进一步进行3因素3水平的响应曲面分析试验，共进行17组试验，其结果见表6。17个试验点可分为两类，其一是析因点，自变量取值在3因素的各自水平所构成的三维定点，共有12个析因点；其二是零点，为区域的中心点。零点试验重复5次，用以估计试验误差。对其试验结果进行分析，其结果见表7。

由表7可知，模型P值小于0.01，为极显著，失拟项P值为0.140 2，不显著。回归方程的R2为0.966 9，调整后的R2为0.924 3，均大于0.8，表明其对模型拟合的可靠性。利用Design-Expert.V.8.0.6软件处理数据得回归方程：

D=21.93-0.92X1-0.29X2-0.21X3+0.16X1X2-0.25 X2X3-1.92X12-1.01X22-0.51X32

根据回归方程做出响应曲面分析，其结果见图1至图3。

从图1至图3中可以看出，D值的大小随着两个因素值的增加呈先升高后降低的趋势，说明各交互因子均有一个最佳组合使D值达到最大。为了求得最佳值，将拟合方程式分别对各自变量求偏导等于零。得到如下方程式：

-0.92+0.16X2-3.84X1=0

-0.29+0.16X1-0.25X3-2.02X2=0

-0.21-0.25X2-1.02X3=0

从而求得X1=-0.25，X2=-0.15，X3=-0.17，经换算得到各因素实际对应水平为：淀粉含量X1=21.66 g/L，培养温度X2=27.70 ℃，培养时间X3=7.75 d。即当淀粉含量为21.66 g/L、培养温度为27.70 ℃、培养时间为7.75 d时，回归方程预测得D值为22.67 mm。经过验证试验，在上述条件下D值为23.00 mm。

3 小结与讨论

本试验运用了响应面法中的Plackett-Burman试验设计、最陡爬坡试验、Box-Behnken试验设计来优化放线菌G5的发酵条件。利用Plackett-Burman试验设计来确定主效应因子为淀粉含量、培养温度、培养天数。利用最陡爬坡试验来确定3个主效因子的变化方向和步长，Box-Behnken试验则用于确定最优值，得出其最优条件为淀粉含量21.66 g/L、培养温度27.70 ℃、培养时间7.75 d。模型预测的D值为22.67 mm，经验证结果为23.00 mm。结果表明模型预测与试验验证结果基本一致，用该模型可以合理、有效地预测D值。

参考文献：

[1] 李 晶，安德荣，刘翠娟，等.放线菌S-159-05抑菌活性物质的初步研究[J].科技与开发，2007，46（11）：755-757.

[2] 李淑彬，杨劲松，刘 阳，等.抗真菌抗生素高产菌株的推理选育及其发酵调控研究[J].中山大学学报，2001，40（4）：13-16.

[3] 郝学财，余晓斌，刘志钰，等.响应面法在优化微生物培养基中的应用[J].食品研究与开发，2006，27（1）：38-41.

[4] 陈秉梅，侯志国，李忠琴，等.基于SAS9.1的芽孢杆菌发酵条件优化[J].计算机与应用化学，2011，28（5）：575-579.

[5] 苏 伟，赵 利，刘建涛，等.黄精多糖抑菌及抗氧化性能研究[J].食品科学，2007，28（8）：55-57.

[6] 肖怀秋，李玉珍.海金沙草总黄酮提取工艺的响应面优化[J].氨基酸和生物资源，2010，34（8）：68-72.

[7] DAVIES O L.The Design and Analysis of Industrial Experiments[M]. New York：Hafner Publishing Company，1967.

1.2.2 最陡爬坡试验 根据“1.2.1”试验的结果确定最陡爬坡试验的爬坡方向和各因素效应值的大小，确定变化步长，快速逼近最优区域[7]。

1.2.3 Box-Behnken试验设计 对试验数据采用多元二次方程来拟合因素和响应面值之间的函数关系，通过对回归方程的分析来寻求最优提取条件，确定最优值。

2 结果与分析

2.1 Plackett-Burman试验设计结果

表2为Design-Expert.V.8.0.6软件设计的12组试验，再利用滤纸片抑菌法得到响应值D。用SPSS软件处理表2中的数据，得到各因素的主要效应及其显著性（表3）。

当P<0.05时影响显著，P<0.01时影响极显著。由表3可知，培养温度和培养时间对发酵液中抗生素产量的影响为显著，淀粉含量对发酵液中抗生素产量的影响为极显著。所以可以将对发酵液中抗生素产量影响不显著的因素控制在一个较好的水平上，选择3个影响显著的因素做进一步的响应面试验。

2.2 最陡爬坡试验结果

由Plackett-Burman试验可知，放线菌G5发酵条件中淀粉含量、培养温度、培养时间3个因素对抗生素的产量有显著影响，其中淀粉含量和培养时间有显著的正效应，应增加；培养温度有显著的负效应，应减少。根据3个因素效应大小的比例设定其变化方向及步长进行试验[4]。

由表4可知，第3组的试验效果最好，所以以第3组试验各因素的水平作为中心点。

2.3 Box-Behnken试验设计及结果

根据Plackett-Burman试验和最陡爬坡试验来确定Box-Behnken试验的因素和水平。具体见表5。

根据Box-Behnken的中心组合设计原理，进一步进行3因素3水平的响应曲面分析试验，共进行17组试验，其结果见表6。17个试验点可分为两类，其一是析因点，自变量取值在3因素的各自水平所构成的三维定点，共有12个析因点；其二是零点，为区域的中心点。零点试验重复5次，用以估计试验误差。对其试验结果进行分析，其结果见表7。

由表7可知，模型P值小于0.01，为极显著，失拟项P值为0.140 2，不显著。回归方程的R2为0.966 9，调整后的R2为0.924 3，均大于0.8，表明其对模型拟合的可靠性。利用Design-Expert.V.8.0.6软件处理数据得回归方程：

D=21.93-0.92X1-0.29X2-0.21X3+0.16X1X2-0.25 X2X3-1.92X12-1.01X22-0.51X32

根据回归方程做出响应曲面分析，其结果见图1至图3。

从图1至图3中可以看出，D值的大小随着两个因素值的增加呈先升高后降低的趋势，说明各交互因子均有一个最佳组合使D值达到最大。为了求得最佳值，将拟合方程式分别对各自变量求偏导等于零。得到如下方程式：

-0.92+0.16X2-3.84X1=0

-0.29+0.16X1-0.25X3-2.02X2=0

-0.21-0.25X2-1.02X3=0

从而求得X1=-0.25，X2=-0.15，X3=-0.17，经换算得到各因素实际对应水平为：淀粉含量X1=21.66 g/L，培养温度X2=27.70 ℃，培养时间X3=7.75 d。即当淀粉含量为21.66 g/L、培养温度为27.70 ℃、培养时间为7.75 d时，回归方程预测得D值为22.67 mm。经过验证试验，在上述条件下D值为23.00 mm。

3 小结与讨论

本试验运用了响应面法中的Plackett-Burman试验设计、最陡爬坡试验、Box-Behnken试验设计来优化放线菌G5的发酵条件。利用Plackett-Burman试验设计来确定主效应因子为淀粉含量、培养温度、培养天数。利用最陡爬坡试验来确定3个主效因子的变化方向和步长，Box-Behnken试验则用于确定最优值，得出其最优条件为淀粉含量21.66 g/L、培养温度27.70 ℃、培养时间7.75 d。模型预测的D值为22.67 mm，经验证结果为23.00 mm。结果表明模型预测与试验验证结果基本一致，用该模型可以合理、有效地预测D值。

参考文献：

[1] 李 晶，安德荣，刘翠娟，等.放线菌S-159-05抑菌活性物质的初步研究[J].科技与开发，2007，46（11）：755-757.

[2] 李淑彬，杨劲松，刘 阳，等.抗真菌抗生素高产菌株的推理选育及其发酵调控研究[J].中山大学学报，2001，40（4）：13-16.

[3] 郝学财，余晓斌，刘志钰，等.响应面法在优化微生物培养基中的应用[J].食品研究与开发，2006，27（1）：38-41.

[4] 陈秉梅，侯志国，李忠琴，等.基于SAS9.1的芽孢杆菌发酵条件优化[J].计算机与应用化学，2011，28（5）：575-579.

[5] 苏 伟，赵 利，刘建涛，等.黄精多糖抑菌及抗氧化性能研究[J].食品科学，2007，28（8）：55-57.

[6] 肖怀秋，李玉珍.海金沙草总黄酮提取工艺的响应面优化[J].氨基酸和生物资源，2010，34（8）：68-72.

[7] DAVIES O L.The Design and Analysis of Industrial Experiments[M]. New York：Hafner Publishing Company，1967.

1.2.2 最陡爬坡试验 根据“1.2.1”试验的结果确定最陡爬坡试验的爬坡方向和各因素效应值的大小，确定变化步长，快速逼近最优区域[7]。

1.2.3 Box-Behnken试验设计 对试验数据采用多元二次方程来拟合因素和响应面值之间的函数关系，通过对回归方程的分析来寻求最优提取条件，确定最优值。

2 结果与分析

2.1 Plackett-Burman试验设计结果

表2为Design-Expert.V.8.0.6软件设计的12组试验，再利用滤纸片抑菌法得到响应值D。用SPSS软件处理表2中的数据，得到各因素的主要效应及其显著性（表3）。

当P<0.05时影响显著，P<0.01时影响极显著。由表3可知，培养温度和培养时间对发酵液中抗生素产量的影响为显著，淀粉含量对发酵液中抗生素产量的影响为极显著。所以可以将对发酵液中抗生素产量影响不显著的因素控制在一个较好的水平上，选择3个影响显著的因素做进一步的响应面试验。

2.2 最陡爬坡试验结果

由Plackett-Burman试验可知，放线菌G5发酵条件中淀粉含量、培养温度、培养时间3个因素对抗生素的产量有显著影响，其中淀粉含量和培养时间有显著的正效应，应增加；培养温度有显著的负效应，应减少。根据3个因素效应大小的比例设定其变化方向及步长进行试验[4]。

由表4可知，第3组的试验效果最好，所以以第3组试验各因素的水平作为中心点。

2.3 Box-Behnken试验设计及结果

根据Plackett-Burman试验和最陡爬坡试验来确定Box-Behnken试验的因素和水平。具体见表5。

根据Box-Behnken的中心组合设计原理，进一步进行3因素3水平的响应曲面分析试验，共进行17组试验，其结果见表6。17个试验点可分为两类，其一是析因点，自变量取值在3因素的各自水平所构成的三维定点，共有12个析因点；其二是零点，为区域的中心点。零点试验重复5次，用以估计试验误差。对其试验结果进行分析，其结果见表7。

由表7可知，模型P值小于0.01，为极显著，失拟项P值为0.140 2，不显著。回归方程的R2为0.966 9，调整后的R2为0.924 3，均大于0.8，表明其对模型拟合的可靠性。利用Design-Expert.V.8.0.6软件处理数据得回归方程：

D=21.93-0.92X1-0.29X2-0.21X3+0.16X1X2-0.25 X2X3-1.92X12-1.01X22-0.51X32

根据回归方程做出响应曲面分析，其结果见图1至图3。

从图1至图3中可以看出，D值的大小随着两个因素值的增加呈先升高后降低的趋势，说明各交互因子均有一个最佳组合使D值达到最大。为了求得最佳值，将拟合方程式分别对各自变量求偏导等于零。得到如下方程式：

-0.92+0.16X2-3.84X1=0

-0.29+0.16X1-0.25X3-2.02X2=0

-0.21-0.25X2-1.02X3=0

从而求得X1=-0.25，X2=-0.15，X3=-0.17，经换算得到各因素实际对应水平为：淀粉含量X1=21.66 g/L，培养温度X2=27.70 ℃，培养时间X3=7.75 d。即当淀粉含量为21.66 g/L、培养温度为27.70 ℃、培养时间为7.75 d时，回归方程预测得D值为22.67 mm。经过验证试验，在上述条件下D值为23.00 mm。

3 小结与讨论

本试验运用了响应面法中的Plackett-Burman试验设计、最陡爬坡试验、Box-Behnken试验设计来优化放线菌G5的发酵条件。利用Plackett-Burman试验设计来确定主效应因子为淀粉含量、培养温度、培养天数。利用最陡爬坡试验来确定3个主效因子的变化方向和步长，Box-Behnken试验则用于确定最优值，得出其最优条件为淀粉含量21.66 g/L、培养温度27.70 ℃、培养时间7.75 d。模型预测的D值为22.67 mm，经验证结果为23.00 mm。结果表明模型预测与试验验证结果基本一致，用该模型可以合理、有效地预测D值。

参考文献：

[1] 李 晶，安德荣，刘翠娟，等.放线菌S-159-05抑菌活性物质的初步研究[J].科技与开发，2007，46（11）：755-757.

[2] 李淑彬，杨劲松，刘 阳，等.抗真菌抗生素高产菌株的推理选育及其发酵调控研究[J].中山大学学报，2001，40（4）：13-16.

[3] 郝学财，余晓斌，刘志钰，等.响应面法在优化微生物培养基中的应用[J].食品研究与开发，2006，27（1）：38-41.

[4] 陈秉梅，侯志国，李忠琴，等.基于SAS9.1的芽孢杆菌发酵条件优化[J].计算机与应用化学，2011，28（5）：575-579.

[5] 苏 伟，赵 利，刘建涛，等.黄精多糖抑菌及抗氧化性能研究[J].食品科学，2007，28（8）：55-57.

[6] 肖怀秋，李玉珍.海金沙草总黄酮提取工艺的响应面优化[J].氨基酸和生物资源，2010，34（8）：68-72.

[7] DAVIES O L.The Design and Analysis of Industrial Experiments[M]. New York：Hafner Publishing Company，1967.