结直肠癌组织中Kiss-1基因启动子甲基化对其表达水平的影响及其临床意义

陈志华,林素勇,陈绍勤,戴起宝,韩宏景

(福建医科大学附属第一医院胃肠外科,福建福州 350005)

结直肠癌组织中Kiss-1基因启动子甲基化对其表达水平的影响及其临床意义

陈志华,林素勇,陈绍勤,戴起宝,韩宏景

(福建医科大学附属第一医院胃肠外科,福建福州 350005)

目的:研究结直肠癌组织中Kiss-1基因启动子甲基化状态对Kiss-1基因表达的影响,分析其与结直肠癌临床病理特性的关系及临床意义。方法:收集126例结直肠癌组织及其癌旁正常结直肠组织,采用甲基化特异性PCR(MSP)检测Kiss-1基因启动子区甲基化状态,采用实时荧光定量PCR和Western blotting法检测结直肠癌组织和正常结直肠组织中Kiss-1基因mRNA和蛋白的表达水平。结果:结直肠癌组织中Kiss-1基因启动子甲基化阳性率(83.33%)高于癌旁正常结直肠组织(30.16%)(P＜0.05)。结直肠癌组织中Kiss-1基因启动子甲基化阳性组Kiss-1基因mRNA和蛋白表达水平均低于Kiss-1基因启动子甲基化阴性组(P＜0.05)。结直肠癌组织中T3＋T4组Kiss-1基因启动子甲基化阳性率高于T1＋T2组(P＜0.05),但Kiss-1基因m RNA和蛋白表达水平低于T1＋T2组(P＜0.05);中和低分化组Kiss-1基因启动子甲基化阳性率高于高分化组(P＜0.05), Kiss-1基因m RNA表达水平低于高分化组(P＜0.05);淋巴结转移组甲基化阳性率高于无淋巴结转移组(P＜0.05),但Kiss-1基因m RNA及蛋白表达水平低于无淋巴结转移组(P＜0.05);远处转移组Kiss-1基因启动子甲基化阳性率显著高于无远处转移组(P＜0.05),但Kiss-1基因m RNA及蛋白表达水平低于无转移组(P＜0.05)。Kiss-1基因启动子甲基化阳性率与患者的性别、年龄、肿瘤部位和大小无明显关联(P＞0.05)。结论:结直肠癌组织中Kiss-1基因启动子甲基化与Kiss-1基因表达水平及结直肠癌的恶性转化特性(特别是转移)有关联,Kiss-1基因甲基化状态有望成为评估结直肠癌转移风险的重要指标。

结直肠肿瘤;Kiss-1基因;DNA甲基化;转移

结直肠癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,其发病率有逐年上升趋势。虽然各种综合治疗手段不断发展,但总体生存率依旧欠佳,其原因主要是远处转移高发生率以及肿瘤局部高复发率,因此抑制和治疗结直肠癌远处转移是影响患者预后重要因素。Kiss-1基因是新近发现的重要的肿瘤转移抑制基因,研究[1-2]证实:Kiss-1基因具有抑制结直肠癌转移的作用,同时发现随着结直肠癌的恶性演进, Kiss-1基因表达呈现不断下调的现象,但其原因尚不明确。Cebrian等[3]发现:在膀胱癌组织中Kiss-1基因Cp G岛存在异常甲基化,与患者的预后有密切关联。但在结直肠癌中Kiss-1基因是否存在异常甲基化、是否与Kiss-1在结直肠癌恶性演进过程中表达缺失有关等,目前暂未见相关报道。本研究通过检测结直肠癌组织中Kiss-1基因甲基化水平,分析其对Kiss-1基因表达的影响,探讨Kiss-1基因甲基化状态与结直肠癌临床病理特性的关系及其临床意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料和主要试剂收集福建医科大学附属第一医院胃肠外科2011年4月—2012年3月手术切除的126例新鲜结直肠癌瘤体及距瘤体10 cm以上的正常结直肠组织标本,液氮保存。入选病例术前均经病理确诊且未经化疗和放疗。年龄15～88岁,平均年龄(58.64±10.75)岁;其中男性65例,女性61例;淋巴结转移48例,无淋巴结转移78例;远处转移11例。主要试剂:DNA提取试剂盒和蛋白酶K购于北京白泰克公司, Na HSO3和C6H4(OH)2购于美国Sigma公司, Wizard DNA Clean-Up System试剂盒购于美国Promega公司,实时荧光定量PCR(Real-time PCR)试剂盒购于美国Invitrogen公司,Kiss-1多克隆杭体购于美国Santa-Cruz公司。Kiss-1基因引物参照文献[4]设计,由上海生物技术工程有限公司合成。见表1。

1.2 甲基化特异PCR①基因组DNA提取:取组织0.3～0.5 cm3液氮研磨,按照说明书步骤提取基因组DNA,琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测DNA浓度及纯度,测定260和280 nm处吸光度(A)值,A260/A280为1.8～2.0时DNA纯度最佳。②DNA修饰及纯化:取2μg DNA加入dd H2O达总体积为50μL,加入3 mol·L－1NaOH,使其终浓度为0.3 mol·L－1,42℃变性30 min,同时新鲜配制10 mmol·L－1对苯二酚及3 mol·L－1亚硫酸氢钠,调其p H值至5.0。变性后DNA样品中加30μL对苯二酚和520μL亚硫酸氢钠,覆盖矿物油,50℃避光水浴16 h。修饰后Wizard DNA Clean-Up System试剂盒纯化,回收DNA并溶于20μL灭菌去离子水,－20℃保存。③甲基化特异性PCR:反应体系25μL,分别为修饰后DNA 3μL,10×Taq Buffer 2μL, 10 mmol·L－1d NTP 0.5μL,25 mmol·L－1MgCl21.5μL,上、下游引物各1μL,Taq酶0.2μL,dd H2O 15.8μL;反应条件:95℃预变性5 min;95℃、30 s,58℃、30 s,72℃、30 s,共35个循环;72℃延伸7 min。取5μL PCR反应产物加入6×上样缓冲液2μL,于2%琼脂糖凝胶上电泳。在每批PCR扩增均设置甲基化阳性对照(Cp G甲基化酶修饰后新鲜胎盘组织DNA为模板)、甲基化阴性对照(胎盘组织DNA为模板)和空白对照组(H2O为模板)。结果判断:Kiss-1基因甲基化特异性引物M有特异产物,而特异性引物U无产物,判断为纯合型甲基化阳性;如果2个都有特异产物,判断为杂合型甲基化阳性;如果U扩展出特异产物,而M无产物,判断为甲基化阴性;如果两者均无特异产物为实验失败,重做。

表1 Kiss-1基因甲基化特异PCR引物及Real-time PCR引物序列Tab.1 Methylation-specific PCR primers and Real-time PCR primers for Kiss-1

1.3 Real-time PCR应用Trizol提取组织RNA,用紫外分光光度仪检测RNA浓度和纯度,取A260/A280比值为1.8～2.1的样品,按照说明书逆转录为cDNA,－20℃保存。反应体系20μL (cDNA 2μL,10μmol·L－1上下游引物各1μL, 2×SYBR Green Real-time PCR Master Mix 10μL,25 mmol·L－1Mg2＋4μL,dd H2O 2 μL)。反应程序:95℃、30 s,95℃、5 s,60℃、31 s,40个循环。用ABI7500 Real-time PCR反应仪检测Kiss-1 m RNA及内参基因β-actin的扩增情况。各cDNA 5倍稀释是最佳模板浓度,溶解曲线示Kiss-1基因PCR产物熔解度峰值在85.0℃,溶解温度均一,峰形状锐利,提示扩增出高特异性产物(图1)。每个样品均设3个复孔。取3份正常结直肠组织总RNA等体积混合作为正常对照样品。用相对定量方法计算Kiss-1基因m RNA的表达量。公式:RQ＝2－△△Ct,△△Ct＝△Ct待测－△Ct正常＝(Ct待测－Ctβ-actin)－(Ct正常－Ctβ-actin)。

1.4 蛋白免疫印迹(Western blotting)检测提取总蛋白,考马斯亮蓝法测定浓度,以150μg总蛋白上样,进行SDS-PAGE(5%浓缩胶,15%分离胶)分离电泳,溴酚兰到达分离胶底部时终止电泳。100 V转膜2 h,使蛋白转移至0.1 nm的NC膜上,常温封闭非特异性抗原2 h,TBST浸洗,加入一抗(1∶200鼠抗人Kiss-1单克隆抗体), 4℃孵育过夜。TBST浸洗,加入二抗(1∶500羊抗兔IgG),4℃孵育过夜。TBST浸洗后灭菌纯化水漂洗后轻轻甩干。按照说明书进行显影曝光,显色后观察,采用化学发光法和GIS1000软件分析系统量化分析。蛋白表达量＝Kiss-1灰度值/ β-actin灰度值。

图1 Kiss-1基因Real-time PCR产物溶解曲线Fig.1 Dissolution profile of Real-time PCR product of Kiss-1 gene

1.5 统计学分析采用SPSS 13.0软件进行统计分析。Kiss-1基因m RNA和蛋白表达水平以±s表示,组间比较采用t检验;Kiss-1基因甲基化阳性率与患者临床病理特征关系的比较采用χ2检验。

2 结果

2.1 Kiss-1基因启动子甲基化检测经Kiss-1基因启动子甲基化特异引物PCR扩增后特异性片段见图2。结直肠癌组织为Kiss-1基因启动子甲基化阳性,正常组织为阴性。

图2 Kiss-1基因甲基化特异PCR产物电泳图Fig.2 Electrophoregram of specific PCR product of Kiss-1 gene methylationM:DNA markerⅠ;Lane 1,2:MSP and Un-MSP primer products of tumor A;Lane 3,4:MSP and Un-MSP primer product of normal A; Lane 5,6:MSP Un-MSP primer products of tumor B;Lane 7,8:MSP and Un-MSP primer products of normal B.

2.2 Kiss-1基因启动子甲基化与Kiss-1基因m RNA和蛋白表达水平的关系结直肠癌组织中Kiss-1基因启动子甲基化阳性组Kiss-1基因m RNA表达水平(0.231±0.048)显著低于Kiss-1基因启动子甲基化阴性组(1.214±0.209) (t＝8.12,P＜0.05)。结直肠癌组织中Kiss-1基因启动子甲基化阳性组Kiss-1基因蛋白表达水平(0.388±0.032)显著低于Kiss-1基因启动子甲基化阴性组(0.945±0.050)(t＝7.66,P＜0.05)。见图3。

图3 Western blotting法检测结直肠癌组织中Kiss-1基因蛋白表达电泳图Fig.3 Electrophonegram of Kiss-1 gene protein expression in colorectal carcinoma tissue detected by Western blotting methodLane 1－6:Coloectal carcinoma tissue 1－6.

2.3 不同临床病理特征的结直肠癌患者Kiss-1基因m RNA表达水平结直肠癌组织中T3＋T4组Kiss-1基因mRNA表达水平低于T1＋T2组,中和低分化组低于高分化组,淋巴结转移组低于无淋巴结转移组,远处转移组低于无远处转移组,差异均有统计学意义(P＜0.05);但Kiss-1基因m RNA表达水平与患者的年龄、性别、肿瘤大小和部位无关联(P＞0.05)。见表2。

2.4 不同临床病理特征的结直肠癌患者Kiss-1基因蛋白表达水平结直肠癌组织中T3＋T4组Kiss-1基因蛋白表达水平明显低于T1＋T2组,淋巴结转移组明显低于无淋巴结转移组,远处转移组明显低于无远处转移组,差异均有统计学意义(P＜0.05);高分化组Kiss-1基因蛋白表达水平略高于中和低分化组,但差异无统计学意义(P＞0.05);Kiss-1基因蛋白表达水平与患者的年龄、性别、肿瘤大小和部位无关联(P＞0.05)。见表2。

2.5 不同临床病理特征的结直肠癌患者Kiss-1基因启动子甲基化阳性率结直肠癌组织中Kiss-1基因甲基化阳性率(83.33%)高于正常结直肠组织(30.16%)(P＜0.05);结直肠癌患者T3＋T4 组Kiss-1基因启动子甲基化阳性率高于T1＋T2 组,中和低分化组高于高分化组,淋巴结转移组高于无淋巴结转移组,远处转移组显著高于无远处转移组,差异均有统计学意义(P＜0.05),但Kiss-1基因启动子甲基化阳性率与患者的性别、年龄、肿瘤大小及部位无关联(P＞0.05)。见表2。

3 讨论

DNA甲基化是最常见的表观遗传学修饰之一,在维持染色体结构、X染色体失活、基因印记和肿瘤发生中起着重要的作用。DNA甲基化是由DNA甲基转移酶(DNMT)催化,将甲基转移到胞嘧啶第5位碳原子上加一个甲基基团,生成5-甲基胞嘧啶(5-mC)的化学修饰过程,由于这种甲基化是发生在DNA复制之后,未改变基因的碱基序列,但可以通过影响基因的表达改变其功能。

正常组织中甲基化发生率很低,但在恶性肿瘤中却发现了许多肿瘤相关基因的启动子区Cp G岛发生了异常甲基化,包括抑癌基因(p16、p15、p14、p73、APC和WTX)[5]、DNA修复基因(h MLH1、GSTP1和MGMT)、细胞黏附相关基因(CDH1和CDH13)、解毒控制基因(GSTP1)和凋亡控制相关基因(DAPK)等,其在肿瘤的发生、发展和转移中发挥作用。在结直肠癌中同样发现了许多抑癌基因异常甲基化[6],导致了结直肠癌的发生和发展,如MLH1、APC、MGMT、RASSF1A和p16等基因均发现Cp G岛异常甲基化现象,导致基因表达降低,从而不能在信号转导、细胞周期调节、DNA修复、血管形成等方面发挥重要功能,促进肿瘤的发生、发展及转移[7-8]。国内外研究[9-13]表明:Kiss-1基因表达缺失与胃癌、脑转移肿瘤、膀胱癌和前列腺癌等多种恶性肿瘤的转移等生物学特性相关,在结直肠癌中Kiss-1基因也发挥着重要的作用。Yamashita等[4]应用MSP方法在胃癌组织标本中发现Kiss-1基因启动子甲基化阳性率为80%。Cebrian等[3]研究发现:膀胱癌组织中Kiss-1基因启动子Cp G岛甲基化阳性率为83.1%,且甲基化阳性组Kiss-1基因表达量明显低于甲基化阴性组(P＝0.037),Kiss-1基因启动子甲基化水平与其表达水平密切相关,推测Kiss-1基因启动子异常甲基化可能导致Kiss-1基因表达下降,从而促进膀胱癌浸润和转移的发生,导致不良预后。

表2 不同临床病理特征结直肠癌患者Kiss-1基因启动子甲基化阳性率和Kiss-1基因m RNA及蛋白表达水平Tab.2 Positive rates of Kiss-1 gene methylation and expression levels of Kiss-1 mRNA and protein in patients with different clinicopathological characteristics

本研究结果显示:结直肠癌组织中Kiss-1基因启动子甲基化阳性率高达83.33%,与Cebrian等[3]报道结果相近。同时发现Kiss-1基因甲基化阳性率与Kiss-1基因m RNA和蛋白表达水平有关联,甲基化阳性患者Kiss-1基因表达水平明显减低,与有关胃癌[4]、膀胱癌[1]等其他恶性肿瘤的文献报道结果一致;Kiss-1基因启动子甲基化阳性率和Kiss-1基因m RNA、蛋白表达水平均与结直肠癌的浸润深度、淋巴结转移及远处转移有关联。Kiss-1基因m RNA和蛋白表达水平也随着肿瘤的浸润深度进展和转移发生而减低,本研究结果与Okugawa等[14]报道结果一致。本文作者推测: Kiss-1基因启动子甲基化的发生可能导致Kiss-1基因表达的沉默,影响结直肠癌转移等生物学特性。Moya等[15]研究发现:Kiss-1基因甲基化可能与结直肠癌患者预后密切相关。

综上所述,结直肠癌组织中Kiss-1基因启动子异常甲基化的现象,可能导致Kiss-1基因的表达水平下调,促进了结直肠癌的恶性演进过程,因此Kiss-1基因甲基化水平有可能成为评估结直肠癌转移风险的指标之一,通过检测结直肠癌Kiss-1基因启动子甲基化阳性率及其表达水平,可以早期预测肿瘤转移风险。同时,基因异常甲基化是一种可逆的过程,通过药物或遗传学处理去甲基化可导致基因重新表达,通过逆转结直肠癌中Kiss-1基因甲基化状态有可能提高Kiss-1基因的表达水平[16],进而降低结直肠癌转移的潜能,这为预防和治疗结直肠癌转移提供了新思路,但有待进一步研究证实。

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Effect of Kiss-1 gene promoter methylation on its expression in colorectal carcinoma tissue and its clinical significance

CHEN Zhi-hua,LIN Su-yong,CHEN Shao-qin,DAI Qi-bao,HAN Hong-jing
(Department of Gastrointestinal Surgery,First Affiliated Hospital,Fujian Medical University, Fuzhou 350005,China)

ObjectiveTo research the effect of the Kiss-1 gene promoter methylation on the Kiss-1 gene expression in colorectal carcinoma tissue,and to analyze the relationship between the Kiss-1 gene methylation and the clinical pathological features of colorectal carcinoma and its clinical significance.MethodsThe Kiss-1 gene promotor region methylation,Kiss-1 gene m RNA and protein expressions were detected respectively by methylation-specific PCR, Real-time PCR and Western blotting method in 126 cases of colorectal carcinoma tissue and para-cacinoma normal colorectal tissue.ResultsThe positive rate of Kiss-1 gene methylation in colorectal carcinoma tissue(83.33%)was significantly higher than that in normal tissue(30.16%)(P＜0.05).In the cancer tissue,the expression levels of Kiss-1 gene m RNA and protein in Kiss-1 gene promoter methylation positive group was lower than that in Kiss-1 gene promoter methylation negative group(P＜0.05).The positive rate of Kiss-1 gene promoter methylation in T3＋T4 stage group was higher than that in T1＋T2 stage group(P＜0.05),but the Kiss-1 gene m RNA and protein expression levels were lower than those in T1＋T2 stage group(P＜0.05).In the poorly and moderately differentiated group,the positive rate of Kiss-1 gene promoter methylation was higher than that in well differentiated group(P＜0.05),but the mRNA expression level of Kiss-1 gene was lower than that in well differentiated group(P＜0.05).In lymph node metastasis group,the positive rate of Kiss-1 gene promoter methylation was higher than that in lymph node negative group(P＜0.05),but the m RNA and protein expression levels were lower than those in lymph node negative group(P＜0.05).And the positive rate of Kiss-1 gene promoter methylation in distant metastasis group was higher than that in non-distant metastasis group(P＜0.05), but the m RNA and protein expressions levels were lower than those in non-distant metastasis group(P＜0.05).There were no significant associations between the positive rate of Kiss-1 gene promoter methylation and the gender, age,tumor location,and tumor diameter of the patients(P＞0.05).ConclusionThe Kiss-1 gene promoter methylation in colorectal carcinoma tissue is associated with the Kiss-1 gene expression level and the malignant characteristics of colorectal carcinoma;Kiss-1 gene promoter methylation may be used as a reference indicator for predicting the risk of metastasis of colorectal carcinoma.

colorectal neoplasms;Kiss-1 gene;DNA methylation;metastasis

R735.3

A

2013-11-17

国家临床重点专科建设项目资助课题(2014);福建省科技厅自然科学基金资助课题(2013J01291)

陈志华(1986－),男,福建省福州市人,医学硕士,主要从事胃肠道肿瘤外科基础和临床研究。

陈绍勤(Tel:0591-87982082,E-mail:chenshaoqin＠medmail.com.cn)

1671-587Ⅹ(2014)05-1074-06

10.13481/j.1671-587x.20140532