血必净对LPS诱导血管内皮细胞NO产生和iNOS及核转录因子κB蛋白表达的影响

宋丽娟,韩 彬

(辽宁医学院附属第一医院呼吸感染科,辽宁锦州 121001)

血必净对LPS诱导血管内皮细胞NO产生和iNOS及核转录因子κB蛋白表达的影响

宋丽娟,韩 彬

(辽宁医学院附属第一医院呼吸感染科,辽宁锦州 121001)

目的:探讨血必净对脂多糖(LPS)诱导血管内皮细胞(VEC)损伤的保护作用,研究在血必净干预下一氧化氮(NO)产生、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达及信号转导机制。方法:将体外培养的VEC分为对照组、LPS(1 mg·L－1)组、LPS(1 mg·L－1)＋血必净(25 g·L－1)组、LPS(1 mg·L－1)＋吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(PDTC,20μmol·L－1)组,在给予LPS前预先用血必净和PDTC孵育1 h。采用Western blotting法检测iNOS和核转录因子-κB p65(NF-κB p65)蛋白的表达情况,采用Griess法检测上清液中NO的水平。结果:与对照组比较,LPS组VEC中NO水平、iNOS和NF-κB p65蛋白表达水平明显升高(P＜0.01)。与LPS组比较, LPS＋血必净组VEC中NO水平、iNOS和NF-κB p65蛋白表达水平明显降低(P＜0.05或P＜0.01);与LPS组比较,LPS＋PDTC组VEC中NO水平和iNOS及NF-κB p65蛋白表达水平均明显降低(P＜0.05或P＜0.01)。LPS＋血必净组与LPS＋PDTC组比较,VEC中NO水平和iNOS蛋白表达水平差异无统计学意义(P＞0.05),LPS＋PDTC组VEC中NF-κB p65蛋白表达水平明显低于LPS＋血必净组(P＜0.05)。结论:血必净能抑制VEC中NO的产生和iNOS蛋白的表达,其机制可能是通过抑制NF-κB而抑制炎症反应。

血必净;核转录因子-κB;诱导型一氧化氮合酶;一氧化氮;血管内皮细胞

近年来研究[1-2]表明:革兰阴性菌感染所引起的脓毒血症可导致败血症性休克、全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome, SIRS)和多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS)等严重疾患,是临床上危重患者死亡的首要原因。经典的抗感染治疗难以有效地控制脓毒血症的发病率及死亡率。位于革兰阴性菌外膜中的脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)亦称内毒素,是其致病的主要物质基础。越来越多的研究[2]表明:血管内皮细胞(vascular endothelial cells,VEC)在LPS引起的内毒素休克和多器官功能衰竭等病理过程中也起关键作用。血必净(Xuebijing,XBJ)是一类中药复合制剂,其主要成分为红花、川芎、丹参、赤芍和当归等,具有抗菌、抗毒和抗炎作用[3]。目前国内研究[4]发现:血必净对内毒素刺激的VEC有保护作用,可缓解VEC受损并可使重要脏器损伤程度减轻,研究[5]显示:血必净同时还具有强效抗内毒素及调节免疫功能的作用。国外研究[6]报道:当发生脓毒症时血必净可通过识别核转录因子κB(nuclear factorκB, NF-κB)起到抑制作用,但这方面的研究报道甚少。本研究观察血必净对LPS激活VEC中诱导型—氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)、NF-κB表达及一氧化氮(nitric oxide,NO)水平的影响,旨在为临床脓毒症致VEC损伤后的保护提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 细胞和主要试剂VEC购自上海交通大学实验室。ECM培养基购自美国Sciencell公司;LPS购自美国Sigma公司,采用PBS配制成2 g·L－1溶液,过滤灭菌后备用;NF-κB抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(pyrrolidine dithiocarbamate, PDTC)和NO试剂盒购自江苏碧云天公司;兔抗人NF-κB p65和iNOS多克隆抗体购自博奥森公司;血必净生药浓度为500 g·L－1,10 m L/支,静脉注射液制剂,购自天津红日制药厂(批号: 080108)。

1.2 VEC培养及鉴定将VEC接种于培养瓶中,采用含5%胎牛血清(FBS)、1%青霉素和链霉素及1%内皮生长因子(ECGS)的ECM培养基培养,2～3 d更换培养液1次,待细胞生长约80%融合时采用0.25胰蛋白酶消化传代,取对数生长期细胞用于实验。采用免疫荧光染色法鉴定。

1.3 实验分组将细胞悬浮液采用无菌ECM培养液洗涤2～3次,取细胞悬液0.1μL,采用0.4%台盼蓝染色后进行细胞计数,将细胞密度调整为1×106个/孔,接种于6孔培养板,置于37℃、5%CO2培养箱中培养24 h。不同浓度血必净对NO水平影响的实验:①对照组,采用含10%胎牛血清的ECM培养液孵育细胞24 h; ②LPS组,将LPS(1 mg·L－1)(预实验得出)与细胞共孵育24 h;③不同浓度血必净组,采用12.5、25.0和50.0 g·L－1血必净预先与细胞孵育1 h,再给予1 mg·L－1LPS与细胞共孵育24 h。血必净和PDTC对NO、iNOS和NF-κB水平影响的实验:①对照组,采用含10%胎牛血清的ECM培养液孵育细胞24 h;②LPS组,将LPS (1 mg·L－1)(预实验得出)与细胞共孵育24 h; ③LPS＋血必净组,采用25.0 g·L－1血必净(通过前一实验得出)预先与细胞孵育1 h,再给予1 mg·L－1LPS与细胞共孵育24 h;④LPS＋PDTC组,采用20μmol·L－1PDTC预先与细胞孵育1 h,之后加入1 mg·L－1LPS再与细胞共孵育24 h。

1.4 NO水平测定收集各处理组细胞上清液, 于4℃、5 000 r·min－1离心5 min,取上清储存于－80℃以检测NO水平。以NO在培养基中形成的稳定终末产物NO2－的浓度代表NO的产生量。离心后取上清液50μL,在各孔中加入50μL Griess reagentⅠ和50μL Griess reagentⅡ,于室温下540 nm波长处测定吸光度(A)值,根据样本的A值从标准曲线上得到样本中NO2－的浓度。

1.5 Western blotting法检测iNOS和NF-κB蛋白表达水平细胞培养24 h,用PBS终止刺激并洗涤细胞2次,用细胞刮勺将细胞刮下,严格按操作步骤提取细胞总蛋白,BCA法测定蛋白水平。取50 g样品煮沸变性后进行SDS-PAGE电泳,转膜,5%脱脂奶粉37℃封闭1 h,加抗iNOS和抗NF-κB p65(1∶400),4℃孵育过夜,洗膜,加入HRP标记的羊抗兔IgG,37℃下孵育1 h,DAB显色,采用图像分析系统分析目标带A值,以目的蛋白与内参β-actin蛋白A值的比值作为目的蛋白的相对表达量。

1.6 统计学分析采用SPSS 17.0统计软件进行统计学处理。各组细胞上清中NO水平和iNOS、NF-κB蛋白表达水平以±s表示,多组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用t检验。

2 结果

2.1 不同浓度血必净作用下LPS诱导的VEC中NO水平与对照组比较,LPS组和LPS＋血必净组VEC中NO水平明显升高,差异有统计学意义(P＜0.01);与LPS组比较,不同浓度量血必净组VEC中NO的水平明显下降(P＜0.05)。25.0 和50.0 g·L－1血必净组VEC中NO水平明显低于12.5 g·L－1血必净组(P＜0.05)。见表1。本实验得出血必净最适浓度为25 g·L－1。

表1 血必净作用下VEC中NO的水平Tab.1 Levels of NO in VEC after treated with XBJ [n＝6,±s,cB/(μmol·L－1)]

表1 血必净作用下VEC中NO的水平Tab.1 Levels of NO in VEC after treated with XBJ [n＝6,±s,cB/(μmol·L－1)]

∗P＜0.05,∗∗P＜0.01 compared with control group;△P＜0.05 compared with LPS group;＃P＜0.05 compared with 12.5 g·L－1XBJ group.

Group NO Control 1.993±0.553 LPS(1 mg·L－1)24.155±5.171∗∗LPS(1 mg·L－1)＋XBJ(12.5 g·L－1)16.672±2.115∗△LPS(1 mg·L－1)＋XBJ(25.0 g·L－1)12.174±1.259∗△＃LPS(1 mg·L－1)＋XBJ(50.0 g·L－1)9.680±2.348∗∗△＃

2.2 血必净和PDTC作用下LPS诱导的VEC中NO水平与对照组比较,LPS组NO的水平明显升高,差异有统计学意义(P＜0.01);与LPS组比较,LPS＋血必净(25 g·L－1)组和LPS＋PDTC组VEC中NO水平明显降低(P＜0.05或 P＜0.01),而后二组比较差异无统计学意义(P ＞0.05)。见表2。

2.3 各组VEC中iNOS蛋白表达水平与对照组比较,LPS组VEC中iNOS蛋白表达水平明显升高(P＜0.01);与LPS组比较,LPS＋血必净组和LPS＋PDTC组VEC中iNOS蛋白表达水平明显降低(P＜0.05或P＜0.01);而后二组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。见图1和表3。

表2 各组VEC中NO水平Tab.2 Levels of NO in VEC in various groups [n＝6,±s,cB/(μmol·L－1)]

∗P＜0.05,∗∗P＜0.01 compared with control group;△P＜0.05,△△P＜0.01 compared with LPS group.

Group NO Control 1.666±0.562 LPS(1 mg·L－1)24.891±2.841∗∗LPS(1 mg·L－1)＋XBJ(25.0 g·L－1)11.806±1.601∗△LPS(1 mg·L－1)＋PDTC(20μmol·L－1)8.822±0.921∗△△

图1 Western blotting法检测各组VEC中iNOS蛋白表达电泳图Fig.1 Electrophoregram of expressions of iNOS protein in VEC in various groups detected by Western blotting method Lane 1:Control group;Lane 2:LPS group;Lane 3:LPS＋XBJ group;Lane 4:LPS＋PDTC group.

表3 各组VEC中iNOS和NF-κB p65蛋白表达水平Tab.3 Expression levels of iNOS and NF-κB p65 proteins in VEC in various groups(n＝3,±s)

表3 各组VEC中iNOS和NF-κB p65蛋白表达水平Tab.3 Expression levels of iNOS and NF-κB p65 proteins in VEC in various groups(n＝3,±s)

∗P＜0.05,∗∗P＜0.01 compared with control group;△P＜0.05,△△P＜0.01 compared with LPS group;＃P＜0.05 compared with LPS＋XBJ group.

Group iNOS NF-κB p65 Control 0.096±0.012 0.043±0.005 LPS(1 mg·L－1)0.844±0.119∗∗0.197±0.036∗∗LPS(1 mg·L－1)＋XBJ (25.0 g·L－1)0.452±0.052∗△△0.104±0.014∗△LPS(1 mg·L－1)＋PDTC (20μmol·L－1)0.297±0.064∗△0.069±0.011∗△△＃

2.4 各组VEC中NF-κB p65蛋白表达水平与对照组比较,LPS组VEC中NF-κB p65蛋白表达水平明显升高(P＜0.01);与LPS组比较, LPS＋XBJ组和LPS＋PDTC组VEC中NF-κB p65蛋白表达水平明显降低(P＜0.05或P＜0.01);与LPS＋血必净组比较,LPS＋PDTC组VEC中NF-κB p65蛋白表达水平明显降低(P＜0.05)。见图2和表3。

图2 Western blotting法检测各组VEC中NF-κB p65蛋白表达电泳图Fig.2 Electrophoregram of expressions of NF-κB p65 protein in VEC in variuos groups detected by Western blotting methodLane 1:Control group;Lane 2:LPS group;Lane 3:LPS＋XBJ group;Lane 4:LPS＋PDTC group.

3 讨 论

血必净是一类活血化瘀的中药复合制剂,含多种药物成分,其中主要有效成分为丹参素、川芎嗪、芍药苷、红花黄色素和阿魏酸等,有以下几种重要的作用:①调节免疫应答;②强效拮抗内毒素;③清除氧自由基;④调节凝血系统的活性;⑤扩张冠脉和外周血管,降低血管通透性等。本研究以VEC为研究对象,以iNOS和NO为靶点探讨血必净保护VEC的作用机制。

目前一氧化碳合酶(NOS)有3种异构体,分别为神经元型一氧化氮合酶(n NOS)、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)和iNOS。其中eNOS有调节钙离子活性的作用,iNOS和n NOS与毒素和细胞因子的介导有密切关系,并参与转录及翻译等一系列复杂的过程从而调节NO的生成量[7]。正常情况下,VEC中iNOS维持在一个较低水平,当受到外界因素如感染及发生应激性反应的情况下,尤其是脓毒血症、SIRS、MODS等,iNOS表达水平明显高于正常水平,最终使NO生成量增高[8]。NO是由NOS催化左旋精氨酸(L-Arg)的氧化反应生成,用以舒张血管和抑制血小板凝集,对维持正常的VEC及其完整性非常重要[9]。然而,在未感染之前,细胞中仅含有微量的NO (pmol),当NO产生过量时,会出现细胞损伤,使毛细血管的通透性增加,渗出增加,同时可以抑制心肌收缩力及降低血管多种收缩因子的敏感度,从而导致感染性休克的发生。

血必净对抗炎症保护脏器的作用已得到多个学者的认可,其相关研究也较多。周红萍等[10]研究发现:血必净可降低体内内毒素的水平;雪琳等[11]在研究LPS诱导发生MODS的模型中观察到血必净能抑制TNF-α的表达;李志军等[12]在家兔研究中得出血必净可降低LPS刺激VEC后产生一系列应激性反应如NOS水平和内皮素表达等。谢颖光等[13]证实:血必净注射液能显著降低重症患者血循环中NO水平,可以保护重症患者的VEC,改善重症患者的病情。朱海云等[14]发现:血必净注射液可降低脓毒症大鼠iNOS表达水平,表明血必净注射液能抑制脓毒症大鼠iNOS的表达。赵光举等[15]观察了血必净注射液对创伤弧菌脓毒症大鼠肺组织iNOS活性和NO水平影响的结果表明:血必净注射液能显著下调肺组织中iNOS活性及NO生成。本研究结果与谢颖光等[13]和朱海云等[14]的研究结果相符合。由此可见,血必净可通过降低NO水平和iNOS表达以改善LPS导致的炎性损伤,从而能起到保护血管内皮的作用。

本研究结果显示:LPS能上调VEC中iNOS 和NF-κB p65表达及NO水平,分别加入血必净及阻断剂组PDTC后,VEC中iNOS、NF-κB p65的表达和NO水平均有所下调,且2组iNOS表达和NO水平下降较接近,这说明血必净抑制VEC 中iNOS表达和NO水平可能是通过抑制NF-κB发挥作用,也间接地反映了LPS可能通过激活NF-κB通路上调iNOS蛋白表达和NO水平,从而发生了瀑布式连锁反应。另外,本实验选择NF-κB p65亚基作为靶基因,发现血必净和NF-κB阻断剂PDTC均显著抑制NF-κB p65蛋白表达。NF-κB p65蛋白是NF-κB的一个关键的转录亚基,最常见的NF-κB以异源二聚体P65∶P50的形式出现[16]。NF-κB作为细胞中重要的核转录调节因子,是多条炎症通路的交汇点[17],这与国内研究[18]报道的血必净能抑制NF-κB的表达、有效降低脓毒症患者病死率,进而抑制血管内膜炎性反应的研究结果相吻合。但由于预先给予血必净及阻断剂处理后未降到正常水平,从而推断LPS感染VEC可能仅部分激活NF-κB,说明还有可能通过其他通路介导。由此可推断:血必净有可能通过抑制NF-κB的激活以抑制LPS诱导的VEC中iNOS表达和NO水平,进而发挥抗炎和保护内皮的作用。

综上所述,血必净可通过抑制NF-κB活性进而抑制炎症反应和VEC损伤,其具体机制有待进一步研究。

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Influence of Xuebijing in production of NO and expressions of iNOS and NF-κB induced by LPSin vascular endothelial cells

SONG Li-juan,HAN Bin
(Department of Respiratory and Infections Medicine,First Affiliated Hospital,Liaoning Medical University, Jinzou 121001,China)

ObjectiveTo investigate the protective effects of Xuebijing(XBJ)on the injury of vascular endothelial cells(VEC)induced by lipopolysaccharide(LPS),and to study the mechanisms of the production of nitric oxide (NO)and the expressions of inducible nitric oxide sytnhase(iNOS)and signal transduction under XBJintervention condition.MethodsThe cultured VEC were divided into control group,LPS(1 mg·L－1)group,LPS (1 mg·L－1)＋XBJ(25 g·L－1)group,LPS(1 mg·L－1)＋pyrrolidine dithiocarbamate(PDTC,20μmol·L－1) group;XBJ and PDTC were administrated 1 h before incubation of with LPS.Western blotting method was used to detect the expressions of iNOS and NF-κB p65 protein.The level of NO in the supernatant was measured by Griess reagent.ResultsComparaed with control group,the NO level and the expression levels of iNOS protein and NF-κB p65 protein in VEC in LPS group were significantly increased(P＜0.01).Compared with LPS group,the NO level and the expression levels of iNOS protein and NF-κB p65 protein in VEC in LPS＋XBJ group weresignificantly decreased(P＜0.05 or P＜0.01);the NO level and the expression levels of NF-κB p65 protein and iNOS protein in VEC in LPS＋PDTC group were significantly decreased(P＜0.05 or P＜0.01).There were no significant differences of the NO levels and the expression levels of iNOS protein between LPS＋XBJ group and LPS＋PDTC group(P＞0.05),but the expression level of NF-κB p65 protein in LPS＋PDTC group was lower than that in LPS＋XBJ group(P＜0.05).ConclusionXBJ can inhibit the production of NO and the expression of iNOS protein in VEC;its mechanism may be related to inhibiting the activation of NF-κB to control inflammation.

Xuebijing;nuclear factorκB;inducible nitric oxide synthase;nitric oxide;vascular endothelial cells

R285.5

A

2013-11-28

辽宁省科技厅自然科学基金资助课题(20092189)

宋丽娟(1981－),女,山西省大同市人,在读医学硕士,主要从事呼吸感染与脓毒症方面的研究。

韩 彬(Tel:0416-4197095,E-mail:hanbin9500＠163.com)

1671-587Ⅹ(2014)05-0997-05

10.13481/j.1671-587x.20140518