脑室内注射5,7-双羟色胺对内侧前额叶皮层锥体神经元5-HT1A受体敏感性的影响

刘彦彤,高 捷,王 爽

(1.西安医学院生物化学与分子生物学教研室,陕西西安710021;2.西安医学院管理学教研室,陕西西安 710021;3.西安医学院病理生理学教研室,陕西西安 710021)

脑室内注射5,7-双羟色胺对内侧前额叶皮层锥体神经元5-HT1A受体敏感性的影响

刘彦彤1,高 捷2,王 爽3

(1.西安医学院生物化学与分子生物学教研室,陕西西安710021;2.西安医学院管理学教研室,陕西西安 710021;3.西安医学院病理生理学教研室,陕西西安 710021)

目的:探讨脑室内注射5,7-双羟色胺(5,7-DHT)对内侧前额叶皮层(mPFC)锥体神经元5-羟色胺-1A(5-HT1A)受体敏感性的影响,阐明5-HT1A受体对锥体神经元电活动的作用。方法:36只雄性SD大鼠随机分为假手术组(n＝21)和5,7-DHT损毁组(n＝15)。损毁组大鼠脑室内注射5,7-DHT,假手术组大鼠脑室内注射同等剂量生理盐水,2组大鼠静脉注射不同剂量(0.5～128.0μg·kg－1)5-HT1A受体激动剂8-OH-DPAT,采用体细胞外电生理学方法观察mPFC中锥体神经元放电频率的变化,并静脉注射5-HT1A受体拮抗剂WAY100635,观察损毁组大鼠对5,7-DHT激动剂和拮抗剂的敏感性,并与假手术组进行比较。结果:在假手术组中,不同剂量(0.5～128.0μg·kg－1)8-OH-DPAT对大鼠锥体神经元的放电频率均产生兴奋-抑制式的影响,这些神经元在低剂量(0.5～32.0μg·kg－1)时被兴奋,放电频率增加(P＜0.05);而在高剂量(128.0μg· kg－1)时则被抑制,放电频率减少。在损毁组中,不同剂量(0.5～128.0μg·kg－1)8-OH-DPAT剂量依赖性地抑制大鼠锥体神经元的电活动(df＝5,F＝3.44,P＝0.003),即放电频率减少,未见兴奋-抑制效应; WAY10035可以反转8-OH-DPAT的抑制作用。结论:脑室内注射5,7-DHT可使大鼠mPFC锥体神经元5-HT1A受体敏感性降低。

5,7-双羟色胺;5-HT1A受体;内侧前额叶皮层;锥体神经元;电生理学

研究[1]证明:内侧前额叶皮层(medial prefrontal cortex,mPFC)中50%～60%的锥体神经元和20%～30%的中间神经元上有5-羟色胺-1A (5-hydroxytryptamine-1A,5-HT1A)受体的表达。5-HT1A受体通过G蛋白与K＋通道耦联。激活5-HT1A受体,可使细胞膜产生超极化,从而降低神经元的活动[2]。实验[3]表明:刺激中缝背核(dorsal raphénuclei,DRN)与中缝中核(median raphénuclei,MRN)可以通过激活5-HT1A受体而抑制m PFC中锥体神经元的电活动。在m PFC中,微电泳5-羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)和5-HT受体激动剂也可以通过5-HT1A受体产生抑制作用。但5-HT递质系统对于mPFC锥体神经元以及5-HT1A受体的作用并不十分清楚。本实验以脑室内注射5,7-双羟色胺(5,7-dihydroxytryptamine,5,7-DHT)大鼠为研究对象,采用神经电生理学方法,静脉注射5-HT1A受体激动剂8-OH-DPAT,记录mPFC锥体神经元放电频率的改变,观察5-HT1A受体敏感性的变化。

1 材料与方法

1.1 实验动物和主要药品36只雄性SD大鼠,体质量230～320 g,由西安交通大学医学院实验动物中心提供,许可证号:SCXK(陕)2007-001。大鼠在标准环境饲养,室温20℃～25℃,24 h昼夜循环光照,自由摄食饮水。大鼠随机分为假手术组(n＝21)和损毁组(n＝15)。5,7-DHT和地西帕明购自美国Sigma公司。

1.2 脑室内注射5,7-DHT损毁组大鼠经4%水合氯醛(400 mg·kg－1)腹腔注射麻醉,头部固定于立体定位仪上,根据《Paxinos-Watson大鼠脑定位图谱》确定左侧mPFC的坐标位置:AP 1.30 mm,L 2 mm,D 3.8 mm[4]。注射5,7-DHT 20 g·L－1:在注射5,7-DHT前,先给大鼠注射地西帕明(25 mg·kg－1)以保护去甲肾上腺素能神经元,30 min后再注射5,7-DHT;假手术组大鼠以相同的方法给予10μL生理盐水。

1.3 电生理记录在脑室注射5,7-DHT后第3周进行电生理记录。大鼠在4%水合氯醛(400 mg·kg－1)腹腔注射麻醉下行气管及静脉插管术后,头部固定于立体定位仪上,根据《Paxinos-Watson大鼠脑定位图谱》,确定右侧m PFC的坐标位置:AP 2.7～3.2 mm,L 0.1～0.6 mm,D 1.5～2.5 mm[4]。在冠状面与中线成2°角处倾斜进针,以避免损伤矢状窦。采用玻璃微电极细胞外记录法记录锥体神经元的放电频率。将信噪比大于3∶1的、稳定的单细胞放电经生物电信号采集与分析系统(CED1401 Spike2)输入计算机后,进行实时观察、储存和频率分析。采样时间10～20 min。整个实验过程中监测大鼠的心电变化和直肠温度(维持在37.0°C±0.5°C)。记录到锥体神经元自发放电后,稳定10 min,然后通过颈外静脉注射连续给予不同剂量(0.5、2.0、8.0、32.0 和128.0μg·kg－1)的8-OH-DPAT溶液,间隔约3 min;最后1个剂量的8-OH-DPAT注射后,再静脉注射给予5-HT1A受体拮抗剂WAY100635 (50μg·kg－1),继续观察放电10 min。每次注射的溶液量为0.1 m L。在药物注射前,记录被确认神经元的基础电活动5～10 min。体循环给予8-OH-DPAT和WAY100635后,观察和分析第2～3 min的放电频率变化。

1.4 锥体神经元的确认mPFC中锥体神经元通常表现为自发放电;AP波宽＞1 ms;呈现规则、不规则或爆发式的放电形式[4]。

1.5 统计学分析采用SPSS 13.0统计学软件进行统计学分析。2组大鼠放电频率均以±s表示,不同剂量8-OH-DPAT作用后放电频率的变化应用单因素方差分析,组间比较以基础放电频率为标准,应用Dunnett’s多重比较。

2 结果

在假手术组中,0.5～128.0μg·kg－18-OHDPAT对大鼠锥体神经元的放电频率均产生兴奋-抑制式的影响;低剂量(0.5～32.0μg·kg－1)时,锥体神经元被兴奋,放电频率增加;而在高剂量(128μg·kg－1)时锥体神经元被抑制,放电频率减少。低剂量的兴奋作用在8.0μg·kg－1时最强,放电频率增加到(3.25±0.70)Hz,与基础放电频率比较差异有统计学意义(P＜0.01);当8-OHDPAT的累积剂量为128.0μg·kg－1时,锥体神经元则被抑制,放电频率下降至(0.07±0.01)Hz;这种抑制作用也可以被WAY100635 (50μg·kg－1)完全反转,使大鼠锥体神经元的放电率恢复为(0.46±0.06)Hz(图1A和表1)。与假手术组比较,在损毁组中相同剂量(0.5～128.0μg·kg－1)8-OH-DPAT剂量依赖性地抑制大鼠锥体神经元的电活动,而无兴奋-抑制效应。8-OH-DPAT只有达到累积剂量128μg·kg－时才能将锥体神经元放电频率抑制到(0.34±0.07)Hz (df＝5,F＝3.44,P＜0.05)(图1 B和表1)。

图1 2组大鼠mPFC中锥体神经元的放电频率Fig.1 Firing rates of pyramidal neurons in mPFC of rats in two groupsA:Sham operation group;B:5,7-DHT-lesion group.

表1 5-HT 1A受体激动剂8-OH-DPAT作用下2组大鼠mPFC锥体神经元放电频率Tab.1 Firing rates of pyramidal neurons in mPFC of rats in two groups after treated with 5-HT1Areceptor agonist 8-OH-DPAT(±s,Hz)

表1 5-HT 1A受体激动剂8-OH-DPAT作用下2组大鼠mPFC锥体神经元放电频率Tab.1 Firing rates of pyramidal neurons in mPFC of rats in two groups after treated with 5-HT1Areceptor agonist 8-OH-DPAT(±s,Hz)

∗P＜0.05,∗∗P＜0.01 compared with basal firing rate.

Firing rate Group n Basal 8-OH-DPAT(μg·kg－1) 0.5 2.0 8.0 32.0 128.0 Sham operation 21 0.35±0.05 1.41±0.30 2.32±0.40 3.25±0.70∗∗1.38±0.17 0.07±0.01 5,7-DHT-lesion 15 1.50±0.29 1.38±0.30 1.23±0.24 1.05±0.21 0.80±0.17 0.34±0.07∗

3 讨论

本实验中所讨论的神经元均位于mPFC内,其电活动的特征符合锥体神经元的鉴定标准。本文作者观察到脑室内注射5,7-DHT后,m PFC的锥体神经元5-HT1A受体敏感性降低,8-OHDPAT对锥体神经元的兴奋-抑制效应消失,可能与以下原因有关:①5-HT1A受体在大鼠脑内的广泛分布,除了存在于锥体细胞的胞体或(和)轴丘上外,5-HT1A受体也在mPFC的γ-氨基丁酸(GABA)能中间神经元上有表达。低剂量8-OHDPAT对锥体神经元产生的兴奋作用,其可能性之一是:mPFC中GABA能中间神经元优先被抑制,释放GABA的量减少,结果导致锥体神经元的去抑制[5]。Diaz-Mataix等[6]也报道了体循环应用低剂量5-HT1A受体激动剂BAY×3702能够导致锥体神经元的电活动增强,并被GABA能中间神经元拮抗剂反转,说明低剂量BAY×3702优先作用于5-HT1A受体;另外,突触前5-HT1A受体可能也参与锥体神经元活动的调节。皮层中也有5-HT7受体表达,并且与Gs蛋白耦联促使c AMP的产生[7],因此刺激5-HT7受体也可能产生神经元的兴奋。8-OH-DPAT对5-HT7受体有很高的亲和力[8],所以小剂量应用8-OH-DPAT对m PFC的锥体神经元产生的兴奋作用也可能是由于兴奋了5-HT7受体所产生的结果。但是,现在并无证据表明在锥体和GABA能中间神经元上有5-HT7受体的表达,这仍需要进一步的研究。低剂量8-OHDPAT对锥体神经元产生的兴奋作用可能性之二, 即8-OH-DPAT产生的兴奋作用是因为作用于其他脑区的5-HT1A受体[9]。许多研究[10]证明:DRN 和MRN对mPFC神经元的活动起重要的调节作用,体循环应用5-HT1A受体激动剂8-OH-DPAT抑制DRN和MRN中5-HT能神经元的电活动,继而对mPFC锥体神经元的抑制作用减弱,导致锥体神经元的电活动增强。②高剂量8-OH-DPAT对锥体神经元产生的抑制作用则很有可能是由于直接激活了所记录的锥体神经元上的5-HT1A受体而产生的反应[11]。虽然不同细胞上5-HT1A受体敏感性的差异还有待进一步研究,但以往的研究支持这种可能性,因为不同神经元上受体表达的水平有差异。③在损毁组,体循环应用8-OH-DPAT (0.5～128.0μg·kg－1)抑制大鼠锥体神经元的电活动,而不是产生兴奋-抑制效应。这种抑制作用在128.0μg·kg－1时具有显著意义,而且可以被WAY100635完全反转,表明这种作用是通过5-HT1A受体实现的。对这种结果的解释可以从以下的研究中得到答案。首先,由于脑室内注射了5,7-DHT,导致了海马结构、中脑缝核和PFC中5-HT1A受体的密度明显降低,因此降低了皮层内5-HT1A受体影响锥体神经元活动的能力。其次,低剂量8-OH-DPAT对锥体神经元产生的兴奋作用在损毁组大鼠中的消失可能是由于来源于缝核和mPFC中GABA能中间神经元的传入增加[12],这些传入能抑制m PFC锥体神经元的电活动,因为5-HT1A受体在GABA能中间神经元和5-HT能神经元上密度降低导致8-OH-DPAT对GABA能和5-HT能神经元活动的抑制作用减弱。另外,低剂量8-OH-DPAT对锥体神经元产生的兴奋作用的消失也可能是由于海马结构向mPFC的GABA能神经元的投射减少,这种投射可以抑制锥体神经元的电活动[13]。

综上所述,本文作者推断:低剂量应用8-OHDPAT使锥体神经元兴奋性作用的消失可能反映了损毁组大鼠5-HT1A受体功能失调或该受体在mPFC、缝核和海马结构中的表达降低。

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Influence of intraventricular injection of 5,7-drhydroxytryptamine in 5-HT1Areceptor sensitivity of pyramidal neurons in medial prefrontal cortex

LIU Yan-tong1,GAO Jie2,WANG Shuang3
(1.Department of Biochemistry and Molecular Biology,Xi’an Medical University,Xi’an 710021,China; 2.Department of Management,Xi’an Medical University,Xi’an 710021,China;3.Department of Pathophysiology,Xi’an Medical University,Xi’an 710021,China)

ObjectiveTo explore the influence of intraventricular injection of 5,7-drhydroxytryptamine(5,7-DHT)in 5-HT1Areceptor sensitivity of medial prefrontal cortex pyramidal neurons in the rats,and to clarity the effect of 5-HT1Areceptor on the eletronic response of pyramidal neurons.Methods36 male SD rats were randomly divided into sham operation group(n＝21)and 5,7-DHT lesion group(n＝15).5,7-DHT was injected intraventricularly in the rats in 5,7-DHT lesion group,and the same dose saline was injected in the rats in sham operation group.The rats in two groups were intravenously injected with different doses(0.5－128.0μg·kg－1)of 8-CH-DPAT.The firing rate of mPFC pyramidal neurons was recorded with extracellular electrophysioologicalexamination.The rats in two groups were intravenously injected with WAY100635,the sensitivites of the rats to 8-OH-DPAT and WAY100635 in 5,7-DHT lesion group were observed,and compared with sham operation group.ResultsThe different doses(0.5－128.0μg·L－1)of 8-OH-DDAT had an excitatory-inhibitory effect on the firing rate of mPFC pyamidal neurons in sham operation group;the neurons were excited when the doses of 8-OH-DPAT were 0.5－38.0μg·kg－1,and the firing rates were increased(P＜0.05);the neurons were inhibited when the dose of 8-OH-DPAT was 128.0μg·kg－1,and the firing rate was decreased.The different doses(0.5－218.0μg·L－1)of 8-OH-DPAT inhibited the elecctronic response of pyramidal neurons of the rats in 5,7-DHT lesion group in a dose-dependent manner(df＝5,F＝3.44,P＝0.003),and the firing rates were reduced.WAY-100635(50μg·kg－1)reversed completely the inhibition of 8-OH-DPAT.ConclusionThe sensitivity of 5-HT1Areceptor of rat mPFC pyramidal neurons can be decreased by intraventricular injection of 5,7-DHT.

5,7-drhydroxytryptamine;5-HT1Areceptor;medial prefrontal cortex;pyramidal neurons; electrophysiology

R338.2

A

2014-04-09

陕西省科技厅科研基金资助课题(2012KJXX-43);陕西省教育厅科研基金资助课题(2013JK0761)

刘彦彤(1980－),女,陕西省咸阳市人,讲师,理学硕士,主要从事神经退行性疾病中枢机制的研究。

王 爽(Tel:029-86177414,E-mail:wangshuang78213＠163.com)

1671-587Ⅹ(2014)05-0958-04

10.13481/j.1671-587x.20140510