不同浓度dbcAMP对SH-SY5Y细胞向γ-氨基丁酸能神经元分化潜能的影响

王登莉,周 莉,于 升,吴 江,赵 慧

(1.吉林大学基础医学院组织学与胚胎学系,吉林长春 130021;2.吉林大学第一医院神经内科,吉林长春 130021)

不同浓度dbcAMP对SH-SY5Y细胞向γ-氨基丁酸能神经元分化潜能的影响

王登莉1,周 莉1,于 升1,吴 江2,赵 慧1

(1.吉林大学基础医学院组织学与胚胎学系,吉林长春 130021;2.吉林大学第一医院神经内科,吉林长春 130021)

目的:建立具有分化成γ-氨基丁酸能神经元潜能的神经干细胞模型,为γ-氨基丁酸能神经元退行性疾病的研究提供适宜的研究载体。方法:应用双丁酰环腺苷酸(dbc AMP)诱导人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y细胞),分为0 mmol·L－1dbc AMP组(对照组)和0.3、0.6、1.0及2.0 dbc AMP组,观察诱导后各组SH-SY5Y细胞的形态变化;采用Imge-Pro Plus 5.0软件测量神经元样细胞神经突起长度,计算神经突起＞30μm细胞所占细胞总数的百分率;采用免疫荧光细胞化学技术检测γ-氨基丁酸能神经元标志性蛋白——谷氨酸脱羧酶65 (GAD65)的表达,并计算其免疫反应阳性率。结果:形态学观察,对照组SH-SY5Y细胞呈多边形、圆形或梭型,胞膜光滑,边界清晰;各浓度dbc AMP组随着dbc AMP浓度的增加和诱导时间的延长,SH-SY5Y细胞胞体变小、突起变长;1.0 mmol·L－1dbc AMP组细胞互相交织,表现出成熟神经元的表型。SH-SY5Y细胞诱导培养72 h后,与对照组(31.4%±4.2%)比较,0.3、0.6、1.0和2.0 dbc AMP组神经突起＞30μm细胞所占细胞总数的百分率(40.1%±5.7%、47.5%±6.2%、73.1%±3.2%和74.3%±6.1%)明显升高(P＜0.05或P＜0.01)。SH-SY5Y细胞诱导培养72 h后,与对照组(10.2%±2.1%)比较,0.3、0.6、1.0和2.0 dbc AMP组GAD65阳性细胞表达率(22.1%±2.4%、46.9%±3.2%、70.7%±3.4%和72.3%±3.7%)明显升高(P＜0.05 或P＜0.01)。结论:SH-SY5Y细胞具有分化为γ-氨基丁酸能神经元样细胞的潜能,1.0 mmol·L－1是dbc AMP的最佳诱导浓度。

双丁酰环磷腺苷;人神经母细胞瘤细胞;诱导;分化

1 材料与方法

1.1 细胞、主要试剂和仪器SH-SY5Y细胞购自美国典型培养物细胞库(American Type Culture Collection,ATCC)。小鼠抗人谷氨酸脱羧酶65 (GAD65)单克隆抗体购自Santa Cruz公司,驴抗小鼠Alexa Fluor 488和DAPI购自美国Invitrogen公司,dbc AMP购自美国Sigma公司,低糖DMEM培养基购自美国Gibco公司,胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)购自杭州四季青生物工程公司,胰蛋白酶购自北京鼎国生物技术有限责任公司。荧光倒置相差显微镜为日本Olympus公司产品(IX71),CO2培养箱为日本Sanyo公司产品(MCO-175),超净工作台为苏净集团安泰公司产品(SW-CJ-1F)。

1.2 细胞传代培养SH-SY5Y细胞采用含10% FBS、60 mg·L－1青霉素及100 mg·L－1链霉素的低糖DMEM培养液,在5%CO2、37℃饱和湿度孵箱中培养。待细胞长到90%融合时,用0.25%的胰蛋白酶消化,以1∶3或1∶4传代,取对数生长期细胞用于实验。

1.3 细胞分组和诱导将SH-SY5Y细胞按1× 104/孔的密度接种于放置了盖玻片的24孔培养板中。为了减少FBS对dbc AMP诱导分化作用的干扰,在诱导实验中将培养基中FBS的浓度降低为0.5%。细胞共分为5组,每组设3个复孔,均用含0.5%FBS的低糖DMEM培养基培养,包括0 mmol·L－1dbc AMP组(对照组)和0.3、0.6、1.0及2.0 mmol·L－1dbc AMP组,将24孔培养板置于37℃、体积分数为5%CO2培养箱中培养,每天于倒置相差显微镜下观察细胞的生长情况并拍照。dbc AMP诱导72 h后,取出细胞爬片进行免疫荧光细胞化学染色。

1.4 神经细胞突起长度测量神经元样细胞神经突起长度的测量方法参照文献[7-8]。以细胞核中心为测量起点,突起末端为终点,使用Image-Pro Plus 6.0软件测量神经突长度,长度＜30μm的突起忽略不计。根据各视野下标尺的测量长度,计算各神经突起的实际长度,并计算出各组细胞神经突起的平均长度。

1.5 免疫荧光细胞化学染色和免疫阳性细胞计数将各组细胞用冷丙酮固定后,0.01 mol·L－1PBS(p H 7.2)冲洗细胞;5%驴血清室温封闭30 min,滴加小鼠抗人GAD65单克隆抗体(效价1∶25)于4℃孵育过夜(阴性对照组用PBS代替GAD65一抗);0.01 mol·L－1PBS冲洗后,避光滴加荧光标记的驴抗小鼠Alexa Fluor 488抗体(效价1∶500),于37℃孵育50 min;0.01 mol·L－1PBS冲洗,DAPI(工作浓度为1 mg·L－1)滴染细胞核5 min,0.01 mol·L－1PBS冲洗;甘油磷酸缓冲液封片后荧光显微镜观察、拍照并计数。20倍物镜下,每个样品随机选取10个视野,分别计算每个视野下的GAD65免疫反应阳性细胞数。

1.6 统计学分析应用SPSS 13.0软件进行统计学处理。各组细胞神经突起的长度和神经突起＞30μm细胞数的百分率以±s表示,组间比较采用t检验。

2 结果

2.1 dbc AMP诱导后SH-SY5Y细胞形态学对照组SH-SY5Y细胞培养48或72 h时细胞呈多边形、圆形或梭型,胞膜光滑,边界清晰。各浓度dbc AMP组细胞培养24 h时可见细胞形态发生改变,细胞两端开始伸出短小的树突样突起。48 h 时0.3 mmol·L－1dbc AMP组只有少数短突起; 0.6 mmol·L－1dbc AMP组突起增多但突起较短,突起交织现象少;1.0 mmol·L－1dbc AMP组细胞两端出现长而细的轴突样突起,并相互交织连接。随着dbc AMP诱导时间的延长,各浓度dbc AMP组细胞形态变化均很明显,诱导72 h时1.0 mmol·L－1dbc AMP组越来越多的细胞突起变长,细胞相互交织现象更明显,表现出成熟神经元的表型,且细胞的平均神经突起长度也随着dbc AMP浓度的增加而变长。见图1。

在诱导72 h时,1.0 mmol·L－1dbc AMP组突起＞30μm的细胞数占细胞总数的(73.1± 3.2)%,与对照组[(31.4±4.2)%]比较差异有统计学意义(P＜0.01);神经突起平均长度为(98.37±4.57)μm,与对照组[(41.77±4.58)μm]比较差异有统计学意义(P＜0.01)(表1)。2.0 mmol·L－1dbc AMP组神经突起平均长度增加,达到(112.86±5.25)μm,突起＞30μm的细胞所占比例为(74.3±6.1)%,与1.0 mmol·L－1dbc AMP组比较无明显变化(P＞0.05)(表2),并且同一放大倍数视野下细胞总数减少。group;E,F:0.6 mmol·L－1dbc AMP group;G,H:1.0 mmol·L－1dbc AMP group;I,J:2.0 mmol·L－1dbc AMP group.“→”:Long neurites after dbc AMP induction;Bar＝50μm.

图1 各组SH-SY5Y细胞形态学Fig.1 Morphology of SH-SY5Y cells in various groupsA,C,E,G,I:48 h after dbc AMP treatment;B,D,F,H,J:72 h after dbc AMP treatment;A,B:Control group;C,D:0.3 mmol·L－1dbc AMP

表1 各组SH-SY5Y细胞神经突起的平均长度Tab.1 Average lengths of neurites of SH-SY5Y cells in various groups(n＝3,±s,l/μm)

表1 各组SH-SY5Y细胞神经突起的平均长度Tab.1 Average lengths of neurites of SH-SY5Y cells in various groups(n＝3,±s,l/μm)

∗P＜0.05,∗∗P＜0.01 vs control group.

Group Average length of neurite (t/h) 48 72 Control 41.43±4.66 41.77±4.58 dbc AMP(mmol·L－1) 0.3 53.61±6.91∗70.11±6.26∗0.6 70.17±7.25∗80.61±7.10∗1.0 84.02±7.83∗∗98.37±7.83∗∗2.0 104.53±8.22∗∗112.86±8.50∗∗

表2 各组神经突起＞30μm细胞占总细胞数的百分率Tab.2 Percentages of cells with neurites longer than 30μm in various groups(n＝3,±s,η/%)

表2 各组神经突起＞30μm细胞占总细胞数的百分率Tab.2 Percentages of cells with neurites longer than 30μm in various groups(n＝3,±s,η/%)

∗P＜0.05,∗∗P＜0.01 vs control group.

Group Percentage of cells with neurites＞30μm (t/h) 48 72 Control 10.32±3.56 31.46±4.22 dbc AMP(mmol·L－1) 0.3 37.23±4.79∗40.17±5.77∗0.6 42.72±4.44∗45.53±6.23∗1.0 62.46±3.44∗∗73.16±3.22∗∗2.0 72.64±5.77∗∗74.33±6.11∗∗

2.2 免疫荧光细胞化学染色及免疫阳性细胞计数

通过免疫荧光细胞化学染色鉴定γ-氨基丁酸能神经元的标志物GAD65的表达,阳性产物被荧光标记的抗体染成绿色,分布在细胞膜上,而阴性对照(即2.0 mmol·L－1dbc AMP组染色过程中未加GAD65一抗)仅有细胞核被DAPI染成蓝色,细胞膜上无特异性染色。0.3 mmol·L－1dbc AMP 组GAD65阳性细胞数量少,阳性率为(22.1± 2.40)%;0.6 mmol·L－1dbc AMP组GAD65阳性细胞数增多,阳性率达到(46.9±3.2)%; 1.0 mmol·L－1dbc AMP组阳性细胞率高达(70.7±3.4)%,与对照组[(10.2±2.1)%]比较差异有统计学意义(P＜0.01);2.0 mmol·L－1dbc AMP组GAD65阳性细胞率为(72.3± 3.7)%,与1.0 mmol·L－1dbc AMP组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。见图2(插页一)。

3 讨论

γ-氨基丁酸能神经元是人类大脑发生过程中基本神经元类型,包括抑制性神经元和兴奋性神经元,前者属中间神经元,释放抑制性神经递质γ-氨基丁酸,参与形成局部抑制回路[9]。在胚胎神经干细胞和成体神经干细胞体外培养时,如果只加入血清不加入任何其他诱导因素,神经干细胞分化的神经元均为γ-氨基丁酸能神经元,该现象提示γ-氨基丁酸能神经元是神经干细胞自然分化的产物。本实验选择的分化诱导剂为细胞本身就存在的第二信使c AMP的衍生物dbc AMP,检测细胞分化的标志性蛋白为γ-氨基丁酸能神经元产生γ-氨基丁酸的限速酶GAD65,以此探讨SH-SY5Y细胞系是否具有神经干细胞特性和能否成为人神经干细胞模型。

由于SH-SY5Y细胞能够在体外长期培养,通过诱导分化可使细胞形态接近成熟神经元,在实验中提供稳定的细胞数,具有许多神经元的生化和生理特征而被作为实验性神经科学研究的神经元细胞模型[10]。SH-SY5Y细胞形态学改变是其细胞分化的表性特征,形态学的成熟程度是判断分化诱导成功与否的重要标志。细胞形态分化成熟的标准为有1个或1个以上的突起长度延伸至胞体直径2倍以上[11];神经元细胞的神经突起长度的测量方法参照Neumann等[7]和Li等[8]的报道,长度＜30μm的突起忽略不计。本研究结合这2种标准,较为准确地对分化后的细胞进行了系统的测量。本实验结果表明:一定浓度dbc AMP可诱导SH-SY5Y细胞形态发生明显的改变,随着诱导剂浓度的逐渐增加,SH-SY5Y细胞从最初的多边形、圆形或梭型逐渐演变为有较长细胞突起的形态,这些突起逐渐伸长并相互交织成网,最长的突起可达120μm,约为细胞体直径的6倍。Dodurga等[12]发现: SH-SY5Y细胞在10 mmol·L－1RA诱导第3天出现神经突起,并随着诱导时间的延长,神经突起随之变长,呈现出神经元表型。上述结果表明SH-SY5Y细胞在一定诱导条件下具有分化为神经元样细胞的潜能。

诱导剂的种类、浓度及作用时间是成功诱导分化干细胞的重要因素。c AMP是细胞内第2信使,其不仅在调节新陈代谢过程中起到很重要的作用,而且能够改变细胞形态,影响细胞分化。体外实验中,c AMP衍生物dbc AMP可以渗透到细胞内,提高细胞内c AMP水平,从而模拟体内某种刺激,所以本实验选择dbc AMP为SH-SY5Y细胞分化的诱导剂[13]。本研究结果显示:经不同浓度dbc AMP处理后,光学显微镜下可见SH-5Y5Y细胞形态发生显著变化,细胞丧失了未分化的肿瘤细胞形态;当dbc AMP浓度为1.0 mmol·L－1时,细胞胞体明显变小,而且伸出长突起,具有类似神经元的形态;而0.3和0.6 mmol·L－1dbc AMP作用下胞体未见明显变化。

2.0 mmol·L－1dbc AMP诱导下,SH-SY5Y细胞神经突起长度及GAD65阳性细胞率与1.0 mmol·L－1dbc AMP组比较无明显改变,并且细胞总数减少,说明高浓度dbc AMP对细胞生长有毒副作用。因此本研究最终确定1.0 mmol·L－1是dbc AMP的最佳诱导浓度。

γ-氨基丁酸能神经元标志性蛋白GAD有2种同工酶,根据其相对分子质量的不同分为GAD65 和GAD67。在神经系统中,GAD65和GAD67通常存在于相同的γ-氨基丁酸能神经元内,但分别由不同的基因编码,在含量和亚细胞分布上存在差异[14]。本研究采用GAD65标记γ-氨基丁酸能神经元,通过免疫荧光细胞化学染色,荧光显微镜下可见GAD65表达部位位于细胞膜上。

综上所述,SH-SY5Y细胞能够成为人神经干细胞模型,其具有神经干细胞特性,在一定条件下可分化为γ-氨基丁酸能神经元。本实验结果为探讨胚胎神经干细胞定向分化的分子机制提供了适宜的研究载体。

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Influence of different concentrations of dbc AMP in differentiation potentiality of SH-SY5Y cells to GABAergic-like cells

WANG Deng-li1,ZHOU Li1,YU Sheng1,WU Jiang2,ZHAO Hui1
(1.Department of Histology and Embryology,School of Basic Medical Sciences,Jilin University,Changchun 130021,China;2.Department of Neurology,First Hospital,Jilin University,Changchun 130021,China)

ObjectiveTo establish a nerve stem cell model possessing the potentiality of differentiating into γ-aminobutyric acid neuron-like cells(GABAergic-like cells),and provide eligible investigative vector for study on GABAergic neurons degenerative diseases.Methods Dibutyryl cyclic adenosine monophosphate(dbc AMP)was applied to induce human neuroblastoma SH-SY5Y cells,and the SH-SY5Y cells were divided into control group (0 mmol·L－1dbc AMP),0.3 mmol·L－1dbc AMP group,0.6 mmol·L－1dbc AMP group,1.0 mmol·L－1dbc AMP group and 2.0 mmol·L－1dbc AMP group;the morphological changes of SH-SY5Y cells were observed.The Image-Pro Plus 5.0 software was used to measure the length of neurites of the neuron-like cells,and the percentage of the SH-SY5Y cells with neurites longer than 30μm was calculated.The immunofluorescence cytochemistry technique was utilized to test GAD65 positive cells,and the positive rate of immune response was calculated.ResultsThe results of light microscope observation showed that the cells in control group were polygonal,circular or shuttle type with smooth membrane and clear boundaries.With the increasing of the concentrations of dbc AMP and the prolongation of time,the morphology of SH-SY5Y cells’bodies became smaller with longer processes in dbc AMP groups.The cells interwined each other and showed mature neuron phenotype in 1.0 mmol·L－1dbc AMP group.Compared with control group(31.4%±4.2%),the percentages of the cell with neurites longer than 30μm in 0.3,0.6,1.0,and 2.0 dbc AMP groups(40.1%±5.7%,47.5%±6.2%, 73.1%±3.2%,and 74.3%±6.1%)72 h after induction were significantly increased(P＜0.05 or P＜0.01).Compared with control group(10.2%±2.1%),the GAD65 positive expression rates in 0.3,0.6,1.0,and 2.0 mmol·L－1,dbc AMP groups(22.1%±2.4%,46.9%±3.2%,70.7%±3.4%,and 72.3%±3.7%)72 h after induction were significantly increased(P＜0.05 or P＜0.01).ConclusionThe SH-SY5Y cells have the potentiality of differentiating into GABAergic-like cells,and 1.0 mmol·L－1is the optimal concentration of dbc AMP.

dibutyryl cyclic adenosine monophosphate;human neuroblastoma cells;induction;differentiation神经干细胞研究多使用小鼠神经母细胞瘤(N2A细胞株)作为细胞模型[1],但在研究人胚胎神经干细胞时,N2A细胞株有一定的局限性,因为小鼠遗传学特征与人类相比有一定差异,尤其是在基因重组研究中不能互为替代,因此寻找一个有神经干细胞特征、适合于研究人胚胎神经干细胞定向分化的细胞模型尤为重要。人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y来源于不成熟的肿瘤性神经嵴细胞,具有干细胞特性,是研究神经细胞终末分化的重要细胞模型。双丁酰环磷腺苷(dibutyryl cyclic adenosine monophosphate,dbc AMP)[2]、脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)[3]、佛波醇酯(tetradecanoyl phorbolacetate,TPA)[4]和维甲酸(retinoic acid, RA)[5]均能诱导SH-SY5Y细胞分化。在RA和BDNF共存的情况下,SH-SY5Y细胞具有向胆碱能神经元分化的表型[6]。但SH-SY5Y细胞能否分化为γ-氨基丁酸能神经元类型,目前尚未见报道。本研究采用不同浓度dbc AMP诱导SH-SY5Y细胞,应用免疫荧光细胞化学技术检测SH-SY5Y细胞向γ-氨基丁酸能神经元分化的潜能,为建立一种适合于研究人类神经干细胞定向分化分子机制的细胞模型提供实验依据。

R741

A

2013-11-22

国家自然科学基金资助课题(81171219);吉林大学211工程项目资助课题(2010)

王登莉(1987－),女,江苏省南通市人,在读医学硕士,主要从事神经干细胞研究。

赵 慧(Tel:0431-85619477,E-mail:zhaohui＠jlu.edu.cn)

1671-587Ⅹ(2014)05-0933-05

10.13481/j.1671-587x.20140505