基于头孢克肟的荧光熄灭效应用于微量铬(VI)的灵敏检测

伍 娉，何婧琳,*，曹小妹，朱爽丽，潘 畅，曹 忠,*

(1.长沙理工大学化学与生物工程学院，电力与交通材料保护湖南省重点实验室，湖南长沙410004)

(2.湖南师范大学化学化工学院，湖南长沙410081)

0 引言

铬不仅是人体必需的微量元素，也是污染环境及影响人类健康的有害金属元素。其中，Cr(VI)与环境和人们的生活密切相关，它在生物体内具有很强的流动性，可通过细胞膜，并促使其氧化，对细胞产生毒害影响，导致病变、甚至致癌，因此对Cr(VI)的分析一直受到人们的高度重视[1～2]。

目前，测定铬的方法主要有火焰原子吸收光谱法[3]、电化学法[4]、电感耦合等离子体原子发射光谱法（ICP-AES）[5～6]、高效液相色谱-紫外检测法（LC-UV）[7～8]、毛细管电泳-紫外检测法（CE-UV）[9]和分光光度法[10]等，这些方法大都存在灵敏度和选择性低、操作繁琐、分析费用高的缺点，导致应用受到限制。Paul等[11]建立了一种显色法检测人体尿液中的Cr(VI)，即利用1,5-二苯卡巴肼（DPC）与 Cr(VI)形成 DPC-Cr(VI)络合物的原理，将试剂加入到尿液中，会立即出现红紫色从而达到检测的目的。荧光分光光度法以其高灵敏度和选择性等优点而得到了广泛的应用，可用于铬的分析测定[12]；Wang等[13]利用二苯乙烯基肾上腺素衍生物作为荧光探针，在加入Cr3+之后，显示出强的红色荧光特性，该方法特异性好。然而，以头孢克肟为荧光探针来测定环境水样中微量Cr(VI)的研究还很少有报道。

头孢克肟是一种口服的第三代头孢菌素抗生素，化学名为7,2(2-(氨基-4-噻唑基)-2-(羧甲氧)乙酰氨基)-3-乙烯基-头孢烯-4-羧酸[14～15]，该药物分子可与一些金属离子形成配合物[16]。Ganjali等[17]发现头孢克肟可作为一种对Yb3+响应敏感的离子载体，并制备了PVC膜电极，实现对Yb3+的电化学检测。

基于此，该文提出了一种基于头孢克肟的微量金属Cr(VI)荧光探针分析方法。该方法使用头孢克肟作为荧光探针试剂、Cr(VI)为电子受体，Cr(VI)受体与头孢克肟供体形成不发光的基态配合物，导致头孢克肟荧光熄灭，从而对Cr(VI)进行定量检测。该方法操作简单、灵敏度高、选择性好，可用于环境水样中Cr(VI)含量的测定，在构建荧光传感分析方法方面具有重要意义。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

LS-45型荧光分光光度计（美国Perkin Elmer公司），TU-1901双光束紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司），BS124S电子天平（北京赛多利斯仪器有限公司），KQ3200B超声波清洗器（昆山市超声仪器公司），95-2型磁力搅拌器 （上海司乐仪器有限公司），CZ-500L-W型超纯水制备仪 （北京国之源有限公司），TG16-W型台式离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司）。

头孢克肟购自于深圳致君制药有限公司，重铬酸钾、甲醇、氯化钾、氯化钠、氯化钙、氯化锌、氯化镁、氯化钡、盐酸购自于上海国药集团化学试剂有限公司，实验用水为经过重蒸馏的去离子水，所用试剂均为分析纯。

1.2 溶液的配制

头孢克肟储备液：称取0.225 0 g头孢克肟粉末于烧杯中，使用甲醇溶解，在磁力搅拌器上搅拌10 min，再在离心机中以3 000 r/min离心5 min，取上清液，转入 25.00mL的容量瓶中，使用甲醇定容、摇匀，其浓度为9.000 mg/mL，使用时可逐级稀释。

Cr(VI)标准储备液：准确称取0.735 5 g重铬酸钾于烧杯中，使用去离子水溶解，转入25.00mL的容量瓶中，用去离子水定容、摇匀，配制成0.200 0 mol/L Cr(VI)溶液，使用时可逐级稀释。

1.3 实验方法

在石英比色皿中，加入适量的头孢克肟和Cr(VI)，以甲醇-盐酸(1.0×10-3mol/L)溶液（1∶1，V/V）为介质，选择激发/发射狭缝宽度为10 nm/10 nm，最大激发/发射波长为397 nm/438 nm。

2 结果与讨论

2.1 识别机理的探讨

头孢克肟为含有硫、氮元素的双杂环分子，能够和一些金属离子如 Cu(Ⅱ)，Cd(Ⅱ)，Fe(Ⅲ)和Ni(Ⅱ)等形成配合物[16]。该实验研究发现头孢克肟可与Cr(VI)形成配合物，其紫外-可见光谱图如图1所示。由图1可知，头孢克肟与Cr(VI)形成的配合物在330 nm和435 nm处存在最大吸收峰（图1d），而头孢克肟的最大吸收峰在280 nm处（图1c），Cr(VI)在盐酸溶液和甲醇-盐酸溶液的吸收光谱在208 nm及310 nm波长处显示出两个波峰（图1a和1b）；当头孢克肟与Cr(VI)作用后，所形成配合物的吸收光谱出现了红移现象（图1d）。

由于头孢克肟分子结构存在较大的共轭体系，具有较强的电荷供体的性质而具备荧光效应。而Cr(VI)是强的电子受体，当Cr(VI)与头孢克肟相互碰撞作用时，会形成不发光的配合物，从而使得头孢克肟的荧光发生淬灭，如图2所示。

2.2 荧光熄灭效应的检测

为了进一步验证该传感方法的可行性，如图2所示，对不同实验体系进行了荧光检测。曲线a显现出较强的荧光，是因为头孢克肟溶液本身由于其特殊的共轭体系分子结构而具备的荧光性质。而当头孢克肟溶液中加入Cr(VI)溶液后（曲线b），荧光强度减弱，表明Cr(VI)受体与头孢克肟供体分子形成基态配合物而产生荧光淬灭作用。由于甲醇分子中的-OH基团的孤对电子跃迁导致其具有微弱的荧光性质[18]，因此实验过程中同时考察了甲醇与 Cr(VI)的相互作用，对比 a、b、c、d曲线可知，甲醇的荧光效应对该荧光淬灭分析方法影响不大。

图1 不同溶液体系的紫外-可见光谱图:a.Cr(VI)/HCl；b.Cr(VI)/甲醇-HCl；c.头孢克肟/甲醇-HCl；d.头孢克肟-Cr(VI)/甲醇-HCl.甲醇-HCl(1.0×10-3 mol/L)介质溶液的体积比为1∶1Fig.1 UV-Vis absorption spectra of different solutions including Cr(VI)/HCl(a),Cr(VI)/methanol-HCl(b),Cefixime/methanol-HCl(c),and Cefixime-Cr(VI)/methanol-HCl(d).The volume ratio of methanol-HCl(1.0×10-3mol/L)media solution is 1∶1

图2 不同溶液体系的荧光光谱图:a.头孢克肟；b.头孢克肟-Cr(VI)；c.甲醇-HCl；d.Cr(VI).[Cr(VI)]=2.0×10-6 mol/L，介质为甲醇-HCl(1.0×10-3mol/L)溶液（1∶1,V/V）Fig.2 Fluorescence spectra of different solutions including cefixime(a),cefixime-Cr(VI)(b),methanol-HCl(c),and Cr(VI)(d).[Cr(VI)]=2.0×10-6mol/L.The media is methanol-HCl(1.0×10-3mol/L)solution(1∶1,V/V)

2.3 头孢克肟质量浓度的优化

头孢克肟溶液浓度过低，则荧光强度值小，而头孢克肟溶液浓度过高，会产生内滤效应使得荧光自淬灭，因此考察头孢克肟溶液浓度对该体系的影响是十分重要的。图3为头孢克肟溶液质量浓度与荧光信号强度值的关系图。选取头孢克肟溶液的质量浓度分别为2.0 mg/mL、3.0 mg/mL、4.0 mg/mL、5.0 mg/mL、6.0 mg/mL、7.0 mg/mL、8.0mg/mL、9.0 mg/mL，测定其荧光强度变化（图3a）。由图可知，随着头孢克肟溶液质量浓度的增加，其荧光效应不断增强，当头孢克肟溶液质量浓度为8.0 mg/mL时，荧光强度值达到最大，继续加大头孢克肟质量浓度，荧光强度由于自淬灭效应而降低，如图3b所示。故实验选用头孢克肟溶液质量浓度为 8.0 mg/mL。

图3 不同质量浓度的头孢克肟溶液的荧光光谱图（a）及头孢克肟溶液质量浓度与其荧光强度的关系图（b）.[Cr(VI)]=2.0×10-5mol/L，介质为甲醇-HCl(1.0×10-3mol/L)溶液（1∶1,V/V）Fig.3 Fluorescence spectra of different concentrations of cefixime(a)and effect of cefixime concentration.[Cr(VI)]=2.0×10-5mol/L.The media is methanol-HCl(1.0×10-3mol/L)solution(1∶1,V/V)

2.4 头孢克肟与Cr(VI)作用时间的优化

由于设计的荧光分析方法是基于物质之间形成基态配合物的原理，因此物质之间相互反应作用时间的优化是十分必要的。实验过程中，将头孢克肟与Cr(VI)的反应时间对测定的影响作为一项优化条件进行考察。图4显示出了不同培育时间对该荧光分析的影响。由图4可知，随着培育时间的增加，反应体系的荧光强度值降低，当时间达到10 min后，该体系的荧光强度值变化不大，说明头孢克肟与Cr(VI)的反应已经达到饱和状态。因此，实验过程中选择10 min为头孢克肟与Cr(VI)的反应最佳时间。

图4 头孢克肟与Cr(VI)的作用时间与荧光强度的关系图.[Cr(VI)]=2.0×10-4mol/L，介质为甲醇-HCl(1.0×10-3 mol/L)溶液（1∶1,V/V）Fig.4 Effect of incubating time between cefixime and Cr(VI).[Cr(VI)]=2.0×10-4mol/L.The media is methanol-HCl(1.0×10-3mol/L)solution(1∶1,V/V)

2.5 选择性的考察

为了考察该方法对Cr(VI)检测的选择性，以常见的 K+、Na+、Mg2+、Ca2+、Ba2+、Zn2+作为干扰离子进行荧光测试（图5）。 固定 Cr(VI)为 2.0×10-4mol/L，其他金属离子的浓度均为 1.0×10-3mol/L。由图5可知，该荧光方法检测Cr(VI)的淬灭比率为 1.5， 而加入 K+、Na+、Mg2+、Ca2+、Ba2+、Zn2+后，该荧光方法检测的淬灭比率约为0.1，即加入K+、Na+、Mg2+、Ca2+、Ba2+、Zn2+后的体系几乎无响应信号，对Cr(VI)的检测不产生干扰，表明该方法对Cr(VI)有良好的选择性。

图5 干扰离子效应柱状图.Cr(VI)的浓度为2.0×10-4 mol/L，K+、Na+、Mg2+、Ca2+、Ba2+、Zn2+的浓度为 1.0×10-3 mol/L.介质为甲醇-HCl(1.0×10-3mol/L)溶液（1∶1,V/V）Fig.5 Effect of interferring ions.The concentration of Cr(VI)is 2.0×10-4mol/L,and K+、Na+、Mg2+、Ca2+、Ba2+、Zn2+1.0×10-3mol/L.The media is methanol-HCl(1.0×10-3mol/L)solution(1:1,V/V)

2.6 Cr(VI)的定量检测

考察了基于头孢克肟的新型载体化合物的微量金属离子荧光探针分析方法的定量分析性能，将不同浓度的Cr(VI)加入体系中，进行荧光分析检测，实验结果如图6所示。 传感体系的荧光强度值随着Cr(VI)浓度的增加而降低（图6a）。图6b为传感体系对应的荧光强度值与Cr(VI)浓度对数的关系图，当 Cr(VI)浓度在 1.0×10-6～2.0×10-3mol/L范围内时，其荧光强度值与Cr(VI)浓度对数呈良好的线性关系，其线性方程可拟合为 F=-25.09lgc-36.61， 线性相关系数为 r=0.995 6，且根据三倍标准偏差法计算得出检测限为 5.8×10-7mol/L，表明该方法对于 Cr(VI)的定量检测具有较好的可行性。相较于复杂的原子吸收、高效液相色谱等仪器分析方法来说，该方法具有操作简单、快速、实用性强的优点，在构建简单灵敏的金属离子分析方法方面具有较好的应用价值。

2.7 水样分析

取云影湖水（湖南长沙）静置，取上清液过滤3～5次之后，加入高温灭菌后的超纯水将湖水样品稀释10倍，在优化的实验条件下，运用加标回收方法，测定湖水样品中加入不同标准浓度Cr(VI)溶液前后荧光强度值的变化，结果如表1所示，可计算出平均回收率为97.23%，说明该荧光探针分析方法对实际样品中Cr(VI)的检测具有较好的可行性，可应用于环境水样中的Cr(VI)含量的检测。

图6 不同浓度Cr(VI)溶液对头孢克肟溶液的荧光光谱图（a）和线性关系图（b）.图中Cr(VI)浓度由上至下分别为：0 mol/L,1.0×10-6mol/L,2.0×10-6mol/L,2.0×10-5mol/L,2.0×10-4mol/L,1.0×10-3mol/L,2.0×10-3mol/L.介质为甲醇-HCl(1.0×10-3mol/L)溶液（1∶1,V/V）Fig.6 Fluorescence spectra(a)and a linear response plot of cefixime for different concentrations of Cr(VI)(b).The concentrations of Cr(VI)from up to down are 0 mol/L,1.0×10-6mol/L,2.0×10-6mol/L,2.0×10-5mol/L,2.0×10-4 mol/L,1.0×10-3mol/L and 2.0×10-3mol/L.The media is methanol-HCl(1.0×10-3mol/L)solution(1∶1,V/V)

表1 水样中Cr(VI)的测定Tab.1 Determination of Cr(VI)in water samples

3 结论

该文利用Cr(VI)受体与头孢克肟供体形成不发光的基态配合物，建立了一种灵敏检测Cr(VI)的荧光探针分析方法。在优化的实验条件下，Cr(VI)溶液浓度对数值与荧光信号值在 1.0×10-6～2.0×10-3mol/L范围内呈线性关系，检测限为5.8×10-7mol/L。 该方法对 Cr(VI)表现出较好的选择性，可用于环境水样中Cr(VI)的灵敏检测。该方法在设计上具有普遍应用性且不需要预处理，可直接进行测定，具有较好的应用前景。

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