协同刺激分子B7-H3在喉鳞癌中的表达及其临床意义

曹金鹏刘凤安苏永进

1.安徽医科大学，安徽 合肥 230032

2.北京大学深圳医院耳鼻喉科，广东 深圳 518000

协同刺激分子B7-H3在喉鳞癌中的表达及其临床意义

曹金鹏1刘凤安2苏永进2

1.安徽医科大学，安徽 合肥 230032

2.北京大学深圳医院耳鼻喉科，广东 深圳 518000

目的 探讨协同刺激分子B7-H3在喉鳞癌中的表达及其临床意义。方法 应用免疫组织化学染色检测27例喉鳞癌患者组织标本及26例声带息肉标本中B7-H3的表达，并对其表达情况与患者淋巴结转移、临床分期、病理分级、临床分型、年龄、性别、吸烟量等进行相关分析。结果 在喉鳞癌组织和声带息肉组织中B7-H3的阳性表达率差别有统计学意义（P＜0.05），B7-H3癌组织中的表达强度与患者淋巴结转移、临床分期、病理分级、临床分型、年龄、性别、吸烟量无统计学差异（P＞0.05）。结论 B7-H3在喉鳞癌组织中确有高表达，在声带组织中低表达或不表达，且表达强度与患者淋巴结转移、临床分期、病理分级、临床分型、年龄、性别、吸烟量无关。说明B7-H3表达与喉鳞癌生物学存在相关性，提示B7-H3表达可作为了解喉鳞癌生物学特性有价值的指标。

B7-H3；喉鳞癌；免疫组化

表1 B7-H3在喉鳞癌组与对照组组织中的表达

表2 B7-H3表达与喉鳞癌临床病理参数的关系

喉鳞癌是头颈部最常见的恶性肿瘤之一，发病率有逐年上升的趋势。早期诊断、早期治疗可明显提高患者的远期疗效。最新研究显示，T淋巴细胞共刺激分子成员B7-H3通过不同途径在肿瘤的发生、发展和转移方面起着重要作用。本研究通过免疫组织化学法(SP法)检测B7-H3蛋白在喉鳞癌组织中的表达，探讨其在喉鳞癌中表达的相关性及其与喉鳞癌发生和发展的关系，为临床治疗新靶点提供依据。

1 材料与方法

1.1 临床资料 收集2007年到2013年在北京大学深圳医院行手术切除的喉鳞癌患者组织标本27例，声带息肉26例，均经过病理确诊。组织标本均用10%甲醛溶液固定,连续切片,片厚4μm。27例喉鳞癌患者，术前均未进行放化疗，其中男性26例，女性1例。有淋巴转移的5例，无淋巴转移的22例(有无淋巴结转移根据术后病理而定)。病理学分级：高分化14例，中分化12例，低分化1例。临床分期采用国际抗癌协会(UICC)2002年公布的TNM分类分期标准：Ⅰ期6例，Ⅱ期9例，Ⅲ期5例，Ⅳ期7例。声门上型9例，声门型18例。年龄39岁～74岁，平均60.6岁。吸烟量≤20支/天有13例，吸烟量大于20支/天有14例。

1.2 主要试剂 鼠抗人B7-H3单克隆抗体(批号sc-376769)购于美国Santa-Cruz公司。SP试剂盒及DAB显色剂均为福州迈新生物技术有限公司产品。

1.3 染色方法 采用免疫组织化学SP法，具体实验步骤按试剂盒说明书进行。每批切片染色均以PBS代替一抗做阴性对照，B7-H3用已知阳性表达的组织切片做阳性对照。一抗稀释比例均为1：100。

1.4 阳性结果判定 B7-H3主要定位于细胞膜上，也见于细胞浆，在400倍显微镜下随机选择5个染色均匀的肿瘤区域进行细胞计数。阳性细胞的密度根据阳性细胞的百分比来进行半定量分级：细胞表达阳性＜10%为（-）；10%～40%为（+）；40%～80%为（++）；大于80%为（+++）。

1.5 统计学方法 采用SPSS19进行统计分析，组间比较采用卡方检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 B7-H3在喉鳞癌中的表达情况 B7-H3阳性表达主要定位于细胞膜上，也见于细胞浆（图1-2），以细胞膜及细胞质呈棕黄色、棕褐色颗粒为阳性细胞。B7-H3在喉鳞癌组织中的阳性表达率(81.5%)高于声带息肉(7.7%)；喉鳞癌组织和声带息肉组织间的表达差异有统计学意义(P＜0.001)，见表1。

3 讨 论

在抗肿瘤及相关领域，激活后的T效应细胞发挥着不容忽视的效用。介导T细胞的活化主要依赖于两个刺激信号[1]：第一类是共刺激信号。共刺激信号能够调节、维持和开启T细胞激活过程的级联反应[2,3]，是T细胞活化所必须的信号。它决定了T细胞的活化、抑制乃至凋亡。共刺激信号分子主要包括3大类：B7家族(免疫球蛋白超家族)，肿瘤坏死因子(TNF)家族和细胞因子家族。这其中免疫球蛋白超家族是绝无仅有的一个可以从APC单向传送信号至T细胞的共刺激分子[4]。如果没有免疫球蛋白超家族的存在，T细胞必然凋亡。第二类信号是MHC(主要组织相容性复合体，major histocompatibility complex)。它可以被特异性的TCR(T淋巴细胞抗原受体，T-cell angigen receptor)所识别，并最终把信号传导到T细胞。MHC虽然为T细胞激活所必需，可是它不会引起T细胞增殖或分泌相应的细胞因子 。

B7家族是一组免疫球蛋白，属于3大类共刺激分子之一。B7同源性3(B7-H3)是2011年由Chapoval[5]等新发现的B7家族成员。B7-H3包含315个氨基酸单体，其胞外区与各B7分子同性：B7-H1(27%)，B7-H2(25%)，B7-1(21%)，B7-2(20%)。B7-H3包括N端信号肽，胞外的IgV和IgC样区，跨膜区和45个氨基酸的胞内区。Northern检测结果显示，B7-H3中存在着4个为4.1kb的mRNA所编码的保守半胱氨酸，它能够保证IgV和IgC的折叠正确。B7-H3的相对分子质量为45～60kD，总共由361个氨基酸单体连接而成。B7-H3mRNA在人类组织中广泛表达[6]。在心脏、肝脏、胎盘、前列腺、睾丸、子宫、胰腺、小肠以及结肠中B7-H3的信使RNA高水平表达，然而其在脑、骨骼肌、肾脏和肺等组 织中的表达水平相对较低[6]。

B7-H3在T细胞上的受体尚未明确，而且其确切的功能还存在争议。一方面，大量研究发现B7-H3在免疫应答中发挥共刺激作用。Chapoval[5]等采用共刺激分析法发现B7-H3对T细胞的活化增殖有共刺激作用。CD4+与CD8+T细胞的增殖、细胞因子干扰素γ和白细胞介素l0的生成都需要B7-H3免疫球蛋白的刺激作用。同时，细胞表面B7-H3转染的黑素瘤细胞还能够提升细胞毒性T淋巴细胞的免疫反应[5]。B7-H3在鼠的几种肿瘤细胞株异位表达后可以诱导肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞的活化，从而延缓肿瘤的生长甚至完全消除肿瘤[7]。另一方面，Suh[8]等也发现B7-H3可以抑制T淋巴细胞的增殖和细胞因子的产生[8]。高水平表达B7-H3的几种人恶性肿瘤细胞与病情的恶性度具有正相关性[9]。B7-H3在肿瘤中作为一种免疫逃逸通路存在，其表达导致T细胞介导的抗肿瘤免疫的下调。因此，肿瘤相关的B7-H3为提高抗肿瘤免疫反应或作为一种药物提供了新的治疗机会[10]。在多种恶性肿瘤中的高表达成为某些肿瘤新的诊断标志物和潜在的治疗靶点。

目前，喉鳞癌是头喉部发病几率最高的恶性肿瘤之一，且近年来，其发病率呈现连续攀升势头。众多的研究结果显示，喉鳞癌的发生是诸多因素共同作用的结果。此外，还有实验显示喉鳞癌的产生也与众多的基因发生了突变有关。比如说，抑癌基因的突变灭活，以及癌基因的顺势表达。基因突变，或将影响基因的表达，以及蛋白质的有序合成，从而进一步导致细胞代谢和增值的紊乱，最终细胞走向癌变，而引发喉癌等恶性肿瘤。伴随近年来基因工程领域的快速发展，癌细胞在基因水平上的变化越来越受重视。因此，寻找特异性的肿瘤标志基因就成了热点。特异性基因对于肿瘤的早期诊断、预防及基因治疗的探索有重要的意义。

B7-H3具备肿瘤调控功能—协同刺激或抑制，而且在其他肿瘤中得到了验证，但是在喉鳞癌研究的很少。本研究发现该因子在喉鳞癌中的表达明显高于对照组，显示该因子在喉鳞癌的发生发展中起到相关作用，虽然未明确其具体的作用机制。如上述喉鳞癌的发病因素多样化，该因子只是其中之一，因此对于淋巴结转移、临床分期、病理分级、临床分型、吸烟量等的问题尚不能给出明确的结论，相信随着样本量的扩大，其相关性也会露出端倪。

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4. Pardoll DM．Spinning molecular immunology into successful immunotherapy[J]．Nat Rev Immunol，2002，2(4)：227-238

5. Chapoval AI，Ni J，Lau JS，et a1．B7-H3：a costimulatory molecule for T cell activation and IFN-gamma production[J] ．Nat lmmunol，2001．2(3)：269-274．

6. Sun X，Vale M，Leung E，et a1．Mouse B7-H3induces antitumor immunity[J]．Gene Ther，2OO3，10(20)：1728-1734

7. Prasad DV，Nguyen T，Li zx． a1．Murine B7一H3 is a negative regulator of T cells [J]．J Immunol，2004，173(4)：2500-2506.

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11.胡洪义,刘均. 喉癌中HPV16/18E6蛋白的表达[J]．罕少疾病杂志,2004,11(3):35-37.

Biological and Clinical Significance of B7-H3 Gene Expression in Laryngeal Squamous Cell Carcinoma

Objective To investigate the role and biological significance of the expression of B7-H3 gene in the carcinogenesis and progression of laryngeal squamous cell carcinoma(LSCC)．Methods The expression of B7-H3 was detected by immunobistocheemistry method in 27 cases of LSCC and 26 cases of vocal cord polyp，and the expression of B7-H3 was analyzed in LSCC with different clinical stages，pathological grades， clinical classi fications，ages，sex，smoking and lymph node metastasis．Results The positive expression rate of B7-H3 in LSCC was obviously higher than that in vocal cord polyp．(P＜0．05)．And there was no correlation with ifferent clinical stages，pathological grades， clinical classifications，ages，sex，smoking and lymph node metastasis．(P＞0．05)．Conclusion The inactivation of B7-H3 is correlated with the carcinogenesis and progression of laryngeal carcinoma． B7-H3 may be a vital target gene for early diagnsis，gene therapy and prognosis of LSCC．

B7-H3； Laryngeal Carcinoma； Immunohistochemisty

图1 B7-H3在喉鳞癌中的阳性表达（SP，×400）

图2 B7-H3在声带息肉中的表达情况（SP，×400）

R739.65

A

10.3969/j.issn.1009-3257.2014.03.03

2014-04-28

临床论著

Original Research

曹金鹏，男，专业为耳鼻喉，安徽医科大学07级研究生，主要研究方向为咽喉恶性肿瘤

刘凤安