秋水仙素诱导四倍体耐热长豇豆的研究

李艳艳，周鸿章，张蜀宁∗，吕 炜，陈俊川

（1.南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室，江苏南京 210095；2.南京理想种苗有限公司，江苏南京 210042）

秋水仙素诱导四倍体耐热长豇豆的研究

李艳艳1，周鸿章2，张蜀宁1∗，吕 炜1，陈俊川2

（1.南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室，江苏南京 210095；2.南京理想种苗有限公司，江苏南京 210042）

以二倍体豇豆荚天下3号为材料，用不同浓度秋水仙素处理其子叶期茎尖生长点，通过对变异株进行形态学、解剖学、农艺学、细胞学鉴定，获得同源四倍体（2n＝4x＝44）。结果表明，0.2%秋水仙素处理4次的效果最佳，四倍体诱变率达到2.33%。与二倍体相比，四倍体植株叶片厚度和宽度、气孔大小、保卫细胞内叶绿体数目、花器官大小、花粉粒大小、种子宽度等均表现巨大性，气孔密度和单果荚种子数明显降低；四倍体豇豆荚果横茎、长度、鲜重、干物质含量等农艺学性状明显高于二倍体。用流式细胞仪进行倍性鉴定，二倍体DNA相对含量为250，四倍体为500。根尖染色体鉴定的结果与流式细胞仪鉴定结果一致。

长豇豆；秋水仙素诱导；四倍体

豇豆（VignasesquipedalisWight.）属于豆类蔬菜，其嫩荚营养丰富，肉质肥厚，炒食脆嫩，也可烫后凉拌或腌泡，是我国主要的常规蔬菜栽培品种之一，在生产上有较大栽培面积。我国栽培豇豆资源的遗传多样性很低［1］，而目前豇豆的育种工作，主要集中在从栽培种质中筛选优良品种，其可选范围较狭隘，应把豇豆育种策略转移到扩大遗传多样性上来。多倍体育种可以培育出优质、高产、抗逆的新品种，已在黄瓜［2］、青花菜［3］、番茄［4］等蔬菜中得到体现。豇豆属于严格的自花授粉植物，经过染色体加倍，不仅扩大了豇豆种质资源，增加遗传多样性，而且还可以克服远缘杂交不亲和性。基于此，本研究旨在创制四倍体豇豆新种质，扩大豇豆育种种质范围。

1 材料与方法

1.1 材料

选取苏浙地区市场上综合性状较好的耐热品种荚天下3号二倍体豇豆（2n＝2x＝22）作为试材，材料由南京理想种苗有限公司提供。试验于2013年6－12月在南京理想种苗有限公司和南京农业大学进行。

1.2 方法

1.2.1 诱导处理

2013年6月11日将催过芽的种子播种在穴盘中，6月17日70%豇豆子叶打开，用秋水仙素溶液点滴生长点，每天6：30－7：00，16：30－17：00各进行1次（1d记为2次）。秋水仙素溶液设为0.1%，0.2%，0.3%等3水平，处理次数为2，4，6次3水平。对照组用蒸馏水处理。

1.2.2 多倍体鉴定

表型变异特征测定。依照对照组豇豆正常生长形态，挑选有明显表型变异的植株。每株选取5～6片完全展开的功能叶片，用测量尺和游标卡尺分别测量叶片长度、宽度、厚度，花器官大小，果荚横茎，商品成熟期和生理成熟期果荚长度，并统计单个果荚种子数。

叶片下表皮气孔特征观察。从变异群体中挑选部分有代表性的植株。撕取叶片下表皮，平铺于载玻片上。用1%碘-碘化钾染色8min，然后于显微镜下进行观察，分别选取10株对照植株和变异植株。每株取2个叶片。每个叶片选取10个视野，统计气孔密度和气孔内叶绿体数目，测量气孔大小，并拍照保存。

花粉粒观察。以对照株花器官作参考，在变异株中选择花瓣大和颜色深的植株，于早上7：00采集花粉，在显微镜下观察，测量大小并拍照保存。

流式细胞仪检测。取对照植株、处理植株的新鲜叶片0.2g。用流式细胞仪测定变异植株和对照植株体细胞DNA的相对含量。具体方法参照张振超等［5］方法。

根尖染色体数观察。将收获的通过流式细胞仪鉴定的M0代四倍体豇豆种子和对照组获得的二倍体豇豆种子，浸泡生根。取1～2cm根尖在0.02mg·L－1的8-羟基喹啉中预处理4h，用卡诺液固定24h，在1mol·L－1HCl60℃解离12min，用改良卡宝品红染色制片，在ZeissAxioskop40显微镜观察并拍照保存。

2 结果与分析

2.1 秋水仙素对豇豆诱导的影响

从表1看出，3种浓度不同处理次数的秋水仙素诱导均可产生变异，获得四倍体植株。随浓度升高和次数增加，变异率增加，存活率逐渐下降，四倍体变异率不成正相关，主要原因可能与秋水仙素毒害作用有关，秋水仙素影响植物的正常有丝分裂行为，分生细胞多次加倍导致后来的植物僵化死亡。以0.3%浓度6次处理总变异率较高，达到89.90%，存活率较低为47.12%，四倍体诱变率为0.96%，并非最佳；而0.2%浓度4次处理的四倍体变异率为2.33%，效果最佳，总变异率为77.33%，存活率为58.72%。在837株存活植株中，共得到16株四倍体。

表1 秋水仙素处理浓度和次数对豇豆诱导效果的影响

2.2 二倍体和四倍体豇豆比较

2.2.1 形态特征

本研究获得的当代四倍体豇豆生长延缓，叶片宽度增加导致叶尖变钝，叶片变厚，叶色加深（图1中A）。尤其以花器官变化最大（图1中B），“巨大性”特征极其显著。调查结果（表2）显示，四倍体的叶厚、翼瓣宽度、花柱粗度、果荚横茎、干物质含量、种子大小与两倍体均存在极显著差异。其中四倍体叶厚、翼瓣宽、花柱粗度、果荚鲜重分别比二倍体增加24.63%，39.53%，27.50%和29.11%；叶片宽度、龙骨瓣长度、果荚横茎依次增加10.11%，9.16%，16.15%；四倍体10粒种子宽和20粒重分别增加10.42%和8.03%；而单个果荚种子数则减少13.21%。

图1 二倍体、四倍体豇豆外部形态器官、气孔、花粉粒及根尖染色体

表2 二倍体和四倍体豇豆形态特征

2.2.2 气孔和花粉粒

四倍体叶下表皮气孔和花粉粒的大小均比二倍体极显著增大（表3，图1中G，H，I，J），四倍体的气孔以及保卫细胞属于整体性增大，但形态基本没有变化。而四倍体的花粉粒不仅整体变大，形态上也变得多样，其中以近似矩形形态出现的花粉粒为多数（图1中J）。从表3看出，四倍体豇豆气孔密度（图1中E，F）减少52.88%，气孔长、宽分别增大46.19%，39.43%，保卫细胞内叶绿体数增加95.72%，花粉粒直径增大24.10%。

2.2.3 细胞DNA相对含量

经形态学和解剖学筛选出27个变异株，对其进行流式细胞仪分析，结果如图2所示，对照植株在荧光强度为250左右出现了1个单峰（左）。变异株中出现了2个结果，其中有11颗在荧光强度250和500附近出现了2个相近的峰（中），表明变异株为嵌合体（2x＋4x）；16颗在500附近出现了1个单峰（右），DNA含量是二倍体（2x）的2倍，表明变异株是四倍体（4x）。

2.2.4 二倍体、四倍体豇豆根尖染色体数的比较

流式细胞仪鉴定的四倍体植株根尖染色体数目为2n＝4x＝44条染色体，是二倍体的2倍（图2中K，L），确定为四倍体。染色体鉴定结果与流式细胞仪鉴定结果一致。

图2 豇豆叶片的DNA相对含量曲线

3 小结与讨论

本研究发现，在秋水仙素处理幼苗生长点20d后，变异植株叶片主要有3种类型：一类生长点死亡，无真叶；二类叶片小、皱缩或畸形；三类叶片颜色变深、变厚，叶尖变钝。经鉴定，四倍体植株主要存在于第3类中，这为以后早期筛选豇豆四倍体工作提供依据。

本研究表明以0.2%浓度4次处理的四倍体变异率为2.33%，效果最好，这与相同方法处理的不结球白菜［5］、萝卜［6］、青花菜［3］等四倍体变异率相比较低，这不仅与品种有关，与外界环境也有一定的联系。本研究在6月份进行，温度较高，秋水仙素处理幼苗条件存在一些困难：要保持水分，避免阳光直射，控制高温防止幼苗徒长，保证点滴在幼苗上的药品渗入生长点。另外高温多雨天气导致豇豆结实率大大降低，这要求更大的样本量，为诱导工作增加一些困难。

［1］ 何礼.我国栽培豇豆的遗传多样性研究及其育种策略的探讨［D］.成都：四川大学，2002.

［2］ 陈劲枫，雷春，钱春桃，等.黄瓜多倍体育种同源四倍体的合成和鉴定［J］.植物生理学通讯，2004，40（2）：149－152.

［3］ 张蜀宁，张丽丽，唐君，等.秋水仙素离体诱导同源四倍体青花菜［J］.园艺学报，2009，36（11）：1681－1684.

［4］ 乔永刚，宋秀英.秋水仙素诱导普通番茄多倍体的研究［J］.山西农业大学学报：自然科学版，2008，28（2）：139－143.

［5］ 张振超，张蜀宁，张伟，等.四倍体不结球白菜的诱导及染色体倍性鉴定［J］.西北植物学报，2007，27（1）：28－32.

［6］ 张红亮，张蜀宁，张伟，等.秋水仙素诱导同源四倍体萝卜的研究［J］.南京农业大学学报，2008，31（3）：47－50.

（责任编辑：张瑞麟）

S643.4

A

0528-9017（2014）08-1174-04

文献著录格式：李艳艳，周鸿章，张蜀宁，等.秋水仙素诱导四倍体耐热长豇豆的研究［J］.浙江农业科学，2014（8）：1174－1177.

2014-04-06

李艳艳（1988－），女，硕士生，主要从事四倍体豇豆和不结球白菜研究工作。E-mail：liyanyan134607＠163.com。

张蜀宁，副教授，硕士生导师，研究方向为蔬菜多倍体育种。E-mail：snzhang＠njau.edu.cn。