李小清,汤 成,潘永林,黄文祥
(1.重庆市中医院 肝病科,重庆 400021;2.重庆市九龙坡区疾病预防控制中心 慢病科,重庆 400039;3.重庆医科大学附属大学城医院 消化中心,重庆 401331;4.重庆医科大学第一附属医院 感染科,重庆 400016)
β-内酰胺类抗菌药物在临床广泛应用, 导致产生β-内酰胺酶的耐药菌株不断增多。 阿莫西林(amoxicillin,AMO)是一种半合成的广谱青霉素,属氨基青霉素类;对流感嗜血杆菌、大埃希菌奇异变形杆菌、沙门菌属、痢疾志贺菌、脑膜炎奈瑟菌和不产酶淋病奈瑟菌等革兰阴性菌有很强的抗菌活性,对钩端螺旋体、梅毒螺旋体也有较好的作用,但AMO 不能抑制可产生β-内酰胺酶的金黄色葡萄球菌和肠杆菌[1]。 将β-内酰胺类抗菌药物与β-内酰胺酶抑制剂他唑巴坦(tazobactam,TAZ)联合应用,拮抗β-内酰胺酶的水解作用,提高抗菌活性,已受到广泛重视[2,3]。本研究观察了不同配比AMO/TAZ 的体内外抗菌作用, 为临床应用提供实验依据。
注射用AMO:规格1.0g/瓶; 批 号L020601; 含 量96.7%; 注射用TAZ: 规格0.1g/瓶; 批号0201001; 含量90.7%。 山东齐鲁制药厂生产。 准确称取各种试验所需药品,加入生理盐水配制成浓度为2560mg/L 的原液。不同配比的药物AMO/TAZ(1∶1、2∶1、4∶1、8∶1)由原液配制。
昆明种小鼠体重20g±2g,250 只,雌雄各半。 动物来源重庆医科大学实验动物中心; 级别: 清洁级; 许可证号:SCXK(渝)2012-0001。
实验所用临床分离菌株包括金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、嗜麦芽窄食假单胞菌、肠杆菌属、鲍曼不动杆菌、沙门氏菌、沙雷氏菌属、枸橼酸杆菌、其他克雷伯菌、铜绿假单胞菌、其他假单胞菌、志贺氏菌等14 种421 株, 其中产酶菌231 株, 产酶率为54.87%。 每株细菌在实验前均经琼脂平板分纯,37℃过夜培养,稀释到0.5 麦氏点用于实验。 每次实验均用大肠埃希菌ATCC25922、 金黄色葡萄球菌ATCC25923 和铜绿假单胞菌ATCC27853 作为药敏实验质控菌株。 细菌在MH培养基、MH 肉汤培养基中37℃培养18~20h。
1.4.1 含药琼脂制备
将已稀释的抗菌药物加入灭菌的MH 琼脂(45~50℃)中充分混匀, 倾入平皿琼脂厚度为4mm。 药物浓度梯度:0.0625,0.125,0.25,0.5,1.0,2.0,4.0,8.0,16.0,32.0,64.0,1 28.0,256.0 mg/L。
1.4.2 细菌接种
将0.5 麦氏比浊度菌液稀释10 倍, 以多头接种器吸取约1~2μl 接种于含药琼脂表面,每点菌数约104CFU,稀释的菌液于15min 内接种完毕。
1.4.3 结果判定
在质控菌株实验结果正确的基础上,将平板置于暗色无反光表面判断试验终点,以抑制细菌生长的药物稀释浓度为终点浓度。
1.5.1 菌液稀释方法
将致病性大肠埃希菌于实验前1d 接种于2ml 营养肉汤中,37℃培养6h, 取此菌液0.1ml 转种于10ml 营养肉汤内,37℃培养18h,即为实验用菌原液。 将菌原液适当稀释,用5%高活性干酵母液稀释至100%最低致死量(MLD)。
1.5.2 (ED50)动物保护实验
实验小鼠随机分为AMO 组,AMO/TAZ (1∶1,2∶1,4∶1)组和空白对照组(注射同体积的生理盐水);每组6 个浓度(各药物用生理盐水溶解后,稀释至所需浓度,2 个相临剂距为0.25~0.5),每个浓度10 只,雌雄各半。 实验组每只小鼠腹腔注射菌量1MLD 菌液0.5ml 以感染小鼠,1h 后皮下给予各组药0.2ml。 记录感染后24h、48h 和72h 各给药组及空白对照组小鼠的死亡数或存活数。
用BLISS 法计算ED50值和ED50的95%可信限, 应用方差分析对数据进行统计分析。
对421 株试验菌在4 种配比AMO/TAZ 联合用药和单用AMO 的MIC50、MIC90进行测试。 对不同配比AMO/TAZ和AMO 间的MIC50进行比较, 经方差分析发现AMO/TAZ(1∶1,2∶1,4∶1)3 种配比与单用AMO 的MIC50差异有统计学意义。 结合不同配比AMO/TAZ 的MIC50显著高于AMO菌种数,以AMO/TAZ 的2∶1、4∶1 配比最佳。 详见表1。
体内保护试验结果,AMO 的ED50值为238.32mg/kg,ED95在447.72mg/kg; 而AMO/TAZ (2∶1、4∶1)ED50分别为46.61mg/kg、51.40mg/kg,比AMO(1∶0)低5 倍左右,差异有统计学意义;AMO/TAZ(2∶1)与AMO/TAZ(4∶1)间ED50差异无统计学意义(见表2)。
表2 AMO/TAZ (2∶1,4∶1)对大肠埃希菌感染小鼠的保护作用
表1 不同比例配比AMO/TAZ 与AMO 的MIC50 比较
AMO 在临床上常用于敏感菌所致的各种感染, 随着其广泛使用, 产生β-内酰胺酶的耐药株不断增多, 单用AMO 对产酶菌株感染无效。 将β-内酰胺酶抑制剂-TAZ与AMO 联合,不仅能克服相应耐药性,还能拓宽抗菌谱,增强抗菌活性。 我们以国产AMO/TAZ 及其单组分进行的体内和体外抗菌活性研究结果显示: 联合用药比单用AMO 的抗菌活性高,抗菌谱也扩大,但几个比配之间有一定差别,无论从MIC 及体内保护试验,AMO/TAZ(2∶1)的抗菌效果均要略强于AMO/TAZ (4∶1), AMO/TAZ 2∶1 为最佳抗菌配比,与文献研究一致[8]。
综上所述,AMO 联合TAZ 后,抗菌活性明显增强。 对所有产酶的革兰氏阳性球菌有较强的抗菌作用;对产酶的革兰氏阴性菌(特别是产ESBLS的菌株)除嗜麦芽胞杆菌及铜绿假单胞菌外也有较强的抗菌作用。 总之,酶抑制剂TAZ 的加入,扩大了AMO 的抗菌谱,增强了抗菌作用,提示临床疗效可能更好,具有进一步开发研究的价值。
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