微观结构与组织工程丝素支架研究进展

孙晴晴，刘源岗，3，王士斌，何鹏

（1华侨大学化工学院化工与制药工程系，福建 厦门 361021；2华侨大学化工学院生物工程与技术系，福建厦门 361021；3华侨大学生物材料与组织工程研究所，福建 厦门 361021）

组织工程融汇医学、生物学和工程学等学科，是近年来的研究热点之一。研究者利用工程学方法制造仿生结构，模拟天然组织的生理环境，包括结构的、物理的以及形态的特征。其中微观结构对最终的组织构建起着至关重要的作用[1]。

目前关于组织工程相关材料的研究相对较多，包括合成材料与天然材料，合成材料如Poly Lactic Acid（PLA）、Poly（L-glycolic acid）（PGA）、Poly（lactic-co-glycolic acid）（PLGA）等，天然材料如胶原蛋白、弹性蛋白、壳聚糖等。其中丝素蛋白纤维作为一种天然的蛋白质纤维具有良好的生物相容性、氧和水蒸气渗透性、生物可降解性、力学性能强等优点而被广泛应用于组织工程，如骨组织[2]、软骨组织[3]、软体组织[4]、角膜[5]、血管[6]、宫颈组织[7]和皮肤[8]等。为了促进丝素组织工程的发展，考虑到微观结构对细胞在支架内的增殖、黏附、向内生长形成组织、营养物质及代谢产物的良好运输等产生的影响，本文将以丝素支架在组织工程中的不同结构为主线，对丝素的不同结构进行总结归纳，分析不同结构的优缺点，以期为今后从微观结构角度设计丝素组织工程支架提供一定的参考依据。

1 丝素蛋白

家蚕蚕丝（Bombyx mori silk）以其独特的力学性能和光泽度而受到广泛关注，且被用作医学缝合线已达数百年之久。近年来，因其具有良好的水溶性、生物相容性、易于化学修饰、体内降解较慢等特性而被用作生物材料。

家蚕蚕丝是熟蚕在蜕变时分泌丝液凝固而成的连续长纤维，由丝素蛋白和包裹在其外部的丝胶构成。丝胶是黏附蛋白，占蚕茧总质量的 25%～30%。丝素蛋白分子量（≥200～350 kDa）较大，包含轻链（Mw约 26 kDa）和重链（Mw约 390 kDa），两条链由一个二硫键连接，同时一个 25 kDa的糖蛋白（P25）也以非共价键的形式与这些链相连[9]。丝素蛋白是一种嵌段共聚物，主要含有亲水性的 β折叠所形成的嵌段，嵌段之间由一些小的亲水片段相连。结晶区基本上是由Gly-X（X为Ala，Ser，Thr，Val）重复序列构成，在这些区域中存在一些富含甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸和酪胺酸的子域[10]。丝素蛋白中的β折叠使其具有较高的力学性能和韧性，研究表明，蚕丝纤维的断裂拉伸强度高达740 MPa[11]。

丝素蛋白除了具有良好的力学性能外，还具有良好的生物降解性，其降解速率与丝素蛋白的结晶度相关，结晶度越高，降解速率就越慢。丝素蛋白体内生物降解速率不仅取决于组织的移植位点和力学环境，还与丝素蛋白在制备过程中的特征参数相关。丝素降解是酶解过程，通过细胞代谢产生多肽链，其降解速度可以通过丝素的处理模式和后期处理来调节，主要是改变丝素的结晶度。一般情况下，β折叠增多，丝素的降解速率会减慢。研究表明，丝素生物材料的降解速率会直接影响人间充质干细胞的代谢，进而改变骨形成的速率[12]。因此丝素蛋白的加工与材料降解之间的联系为丝素用于生物医学材料提供了坚实的基础。目前，丝素蛋白在组织工程支架中得到了广泛的应用，并根据组织的不同需要制备出了不同的结构。

2 不同丝素支架的结构

2.1 多孔结构

在3D聚合物支架中，孔洞结构在组织工程中发挥着关键性的作用，它为接种在支架中的细胞形成功能性组织提供了至关重要的框架结构[1]。近年来研究表明，支架的几何学形貌决定了细胞在支架内构建的组织结构。为了使多孔聚合物支架适用于不同组织的构建，如何改进多孔聚合物支架的构建及制备已经成为研究的热点。且孔洞的形状、大小、孔壁的厚度和粗糙度等对种植在支架中的细胞的活性、增殖及分化等均会产生不同的影响。下面以骨组织的体外构建为例，列举了几种不同的结构对组织构建的影响。

Correia等[13]分别以水和六氟异丙醇为溶剂制备了片层孔和球形孔的多孔支架，结果表明，球形孔（孔径400～600 μm）更利于骨组织的生长分化。然而Oliveira等[14]却发现，将冻干法制备出的片层孔结构用于骨组织体外结构时，片层孔结构对细胞产生了接触导向的作用，诱使新形成的胶原沿着片层孔的走向分泌。因此不同的孔洞形状在组织工程中也有不同的应用。

Wang等[15]分别利用冻干法和盐析法制备的多孔丝素蛋白支架用于体外软骨组织构建。结果表明，盐析法制备出的丝素支架具有较大的孔径、较高的孔隙率和结晶度，利于细胞在支架内均匀分布，并提高了细胞的增殖和分化能力。然而为了更准确地模拟天然软骨的不同孔径结构，Hofmann等[16]利用盐析法制备出大孔（孔径400～500 μm）与小孔（孔径112～224 μm）共存的丝素支架用于软骨组织构建，其中大孔结构和小孔结构分别分布在支架的两端。通过比较细胞在大孔结构、小孔结构及大小孔结构上的增殖、活性及分化能力等，可以看出大小孔共存的结构在动态培养下更利于细胞的增殖分化，且细胞活性更高。因此准确地模拟天然组织的结构对成功构建组织有较大的影响。

Makaya等[17]分别采用蔗糖及氯化钠为致孔剂，相应地以六氟异丙醇及水为溶剂制备了两种多孔丝素支架。其中蔗糖/六氟异丙醇支架内部孔洞为圆形，孔壁较薄且均一；而氯化钠/水制备出的支架孔洞为方形，孔壁较厚、表面粗糙且是微孔状的。将软骨细胞种植在两种支架中发现形成的软骨组织在蔗糖/六氟异丙醇支架中分布较为均匀，这是因为支架的孔壁较薄，在软骨形成过程中孔壁发生收缩利于软骨组织沉降物的分散。

综上所述，不同的结构对于组织构建会产生不同的影响，准确模拟天然组织的结构是成功构建组织的关键因素之一。除了上述列举的方法与应用外，作者实验室采用热致相分离法制备了丝素支架，通过调节制备条件可以得到不同结构特征的丝素支架，如图1所示，其中图1(a)显示支架表面所形成的孔洞为条形孔，图1(b)中显示支架表面形成的孔洞结构为圆形孔。

2.2 纤维结构

图1 丝素蛋白支架表面孔洞结构的电镜图

天然细胞外基质（extracellular matrix，ECM）主要由两类大分子构成：①多糖类，被称为黏多糖（GAGs），通常与蛋白共价连接形成蛋白聚糖；②纤维蛋白，如胶原蛋白、弹性蛋白、纤连蛋白及层粘连蛋白，它们同时具有结构功能和黏附功能[18]。蛋白聚糖分子形成高度水合凝胶，组装的纤维蛋白被嵌入其中，并与细胞通过力学的和化学的信号相互作用。因此，基于天然 ECM 结构特征，纳米技术尤其是纳米纤维技术，因其适于构建人工基质已经成为这个领域的重要方向。一般制备纳米纤维结构的方法有自组装[19-20]、相分离[21]和电纺技术[22]等。除了传统的纳米纤维结构外，为了满足不同组织对支架的不同力学要求，近年来又新兴了很多纳米纤维结构。

Santos等[23]将淀粉与聚已内酯（质量比 30∶70）制备成纳米纤维与微米纤维共混的支架，其中纳米纤维利于细胞的黏附和增殖，而微米纤维则对支架提供力学支撑。随后 Sahoo等[24]将聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）纳米纤维涂层在丝素微米纤维编织支架上形成共混支架，这种复合方式不仅使支架的力学性能得到了提高，而且为细胞在表面上的增殖与黏附提供了更大的接触面，增加细胞支架上下表面的增殖率。但是，微米纤维的加入是否会影响细胞在支架上的生长呢？Bondar等[25]为人们解除了这方面的担忧，他们通过对比内皮细胞在丝素纳米纤维与微米纤维支架上的生长情况得出，内皮细胞在纳米纤维和在微米纤维上的细胞间接触分子的表达或细胞增殖率上并无显著性差异。

除了将微米纤维结构加入到纳米纤维结构提高支架的力学性能外，细胞外基质中的环形结构对组织的生物力学性能也起着关键性的作用。Bhattacharjee等[26]将丝素与壳聚糖交联制备了环形的纤维支架用于椎肩盘组织的再生。壳聚糖的加入提高了支架的硬度，环形的层状纤维诱导细胞延着纤维的方向黏附、生长及分化，同时提高了支架的力学性能。当然，多股纳米纤维以不同的方式组合同样可以提高支架的力学性能。Li等[27]将两股丝素纤维丝（共3456根）相互缠绕形成的纤维簇（即wired结构）用于前交叉韧带（anterior cruciate ligament，ACL）的体外构建，通过对比另外两种结构（辫子形和直线形）得出， wired结构的支架力学性能明显高于其它两种，可媲美天然 ACL的力学性能。

2.3 纤维-多孔结构

纤维结构具有较大的比表面积，利于细胞的黏附和增殖，但辫子状、直线状及wired形状的纤维结构等由于其相对致密的结构而不利于营养物质的运输，同时降低了细胞的接种量以及细胞在支架内部的渗透和细胞外基质的分泌。因此多孔结构在纤维支架里发挥着重要作用。Liu等[28]将编织的丝素支架与多孔的丝素海绵结合用于韧带组织工程。这种结构一方面利于支架的传质，另一方面用多孔的丝素海绵代替传统构建韧带组织时所加入的凝胶，便于细胞在支架内的渗透，而且克服了细胞-凝胶在体内动态环境中被排斥的弊端。

对于多孔支架来说，加入纤维可以提高细胞的黏附及分化能力，同时也提高了支架的力学性能[25]。Stoppato等[29]将氯化钠与丝素纤维混合利用盐析法制备混有丝素纤维的聚乳酸多孔支架，结果表明，加入丝素纤维后，支架的性能得到了提高，同时增加了支架对内皮细胞的体外供养能力以及体内血管化的能力。

图2 不同放大倍数下支架表面的电镜图

由此可见，纤维-多孔结构支架中的纤维结构可以提高细胞在支架上的黏附和增殖能力，而多孔结构则利于细胞在支架上向内生长，促进营养物质及代谢产物在支架内的运输及传递，拥有了多孔结构和纤维结构在组织构建中的双重优势。作者实验室利用热致相分离法制备了多孔的丝素纤维支架，如图2所示，支架表面形成了多孔的纳米纤维与微米纤维共混的结构，其中纳米纤维可以促进细胞在支架表面的黏附与增殖，而微米纤维除了具有促进细胞在支架表面的黏附与增殖外，还对支架的结构起到支撑的作用。

2.4 水凝胶结构

丝素水凝胶是丝素蛋白水溶液在酸、脱水剂、离子、超声处理或者冻干的作用下由溶胶转变成凝胶而得。蛋白浓度的增加，温度的升高以及Ca2+的加入都可以加速溶胶-凝胶的转变。丝素水凝胶可用于注射或非注射传递系统，且研究表明丝素水凝胶的力学性能适于组织工程相应组织的体外构建。

Fini等[30]将成骨细胞包载在丝素水凝胶内体外培养一段时间后，用于兔子远端股骨极量缺损的修复治疗。研究结果表明，在丝素水凝胶中，TGF-β1的表达显著增加，新形成骨中骨小梁的体积、厚度和面积等都有显著提高，且新形成的骨结构与正常骨相似，说明丝素水凝胶加速了修复的过程。Diab等[31]以鼠股骨节段极量缺损为模型，将载有骨形成蛋白-2（bone morphogenetic protein 2，BMP-2）的丝素水凝胶填充在纳米纤维聚已内酯（polycaprolactone，PCL）网眼管中用于大骨缺损的治疗，研究结果表明，丝素水凝胶是 BMP-2的优良载体，而且在实验结束时被完全降解，避免了支架在构建组织时所产生的免疫排斥等不良反应。

除了传统的将丝素水凝胶用于单独包载蛋白或细胞外，Davis等[32]将分离出来的胰岛细胞直接用水凝胶包载，同时共载 ECM 蛋白及间充质干细胞用于治疗1型糖尿病。结果表明，共载时胰岛素的分泌量是对照的3.2倍，同时囊化胰岛细胞的功能基因表达量及相关功能蛋白的表达量均增加，同时去分化蛋白表达量降低，这些结果说明了以丝素水凝胶为载体用于胰岛的体外移植是有望达到的。此外，作者实验室利用超声法制备了丝素水凝胶并将其与微囊化细胞复合，水凝胶结构可以为微囊化细胞提供良好的营养及代谢运输，微囊可以为细胞提供较大的比表面积，便于细胞的黏附和增殖。图 3所示便为丝素水凝胶与微囊化细胞的复合体。

水凝胶由于它的高含水量以及与天然组织相似的力学性能而被用于药物载体及组织工程中。其中可注射水凝胶可以降低凝胶在应用过程中的侵袭性，这反过来还可以降低手术成本及康复成本[33]。可注射水凝胶主要用于一些有空间可供注射的位点，并可通过以下方式制备：物理交联、化学交联、酶诱导交联和离子交联/自组装。Zhang等[34]利于超声诱导制备出可注射丝素水凝胶并包载血管内皮生长因子-165（vascular endothelial growth factor，VEGF165）及BMP-2用于提升上颌窦底，结果表明共载两种生长因子的水凝胶系统提升上颌窦底较明显，且组织内有血管生成。

图3 复合物及复合物内细胞的图像

2.5 其他结构

除了上述支架结构外，还有一些其他支架结构被用于不同的领域。Wray等[35]将聚四氟乙烯包裹的不锈钢丝（直径152～787 μm）线性排列构建丝素支架中孔洞通道，并将这种支架用于大尺寸组织的构建，其中不锈钢丝产生的孔洞可用于体外血管化的构建。除此这外，在丝素支架表面涂层磷灰石用于骨组织构建[36]、丝素与生物玻璃复合用于骨质疏松的治疗等也在一定程度上扩展了丝素蛋白在组织工程中的应用。

3 总结与展望

通过以上对丝素支架的不同结构在组织工程中的应用可知，丝素在组织工程支架中发挥着较大作用。但如何有效地、精准地模仿天然组织以用于体外构建组织，还需要进一步研究天然组织的结构（分子及原子水平），并寻找合适的材料及方法精确地模拟组织结构。有理由相信，随着组织工程的进一步发展，丝素在组织工程中的应用前景将更为广阔。

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