拟南芥VHA-c基因的矿质营养调节

张春霖，尚世辉，王瑞刚

（内蒙古农业大学生命科学学院，内蒙古 呼和浩特 010018）

拟南芥VHA-c基因的矿质营养调节

张春霖，尚世辉，王瑞刚

（内蒙古农业大学生命科学学院，内蒙古 呼和浩特 010018）

对Ca2＋和MS营养处理转VHA-c-GUS烟草叶片的GUS表达活性进行分析。研究结果表明：VHA-c2和VHA-c3可被Ca2＋促进表达，而VHA-c5的表达则被Ca2＋抑制。同时，MS营养成分可显著促进VHA-c2、VHA-c3和VHA-c5基因的表达。这说明VHA-c基因可被Ca2＋和MS等营养成分调控表达。

拟南芥；VHA-c；GUS；Ca2＋；MS培养基；离子转运；Ca2＋／H＋反向传递体

0 引言

植物是自养生物，它能够从环境中吸收无机营养，并在体内与碳骨架同化合成为自身的组成成分［1］。研究表明：矿质营养大多从土壤中以离子的形式经过细胞膜而进入植物细胞内［2］。有关这些矿质离子的转运机制，在20世纪30年代以来得到许多有意义的证据，并有人据此提出了许多有关的假说。其中，M itchell在20世纪60年代提出的化学渗透学说，被人们广为接受。近年的很多研究结果均支持这个假说，并把它完善起来［3］。质子泵学说认为，质子泵的重要功能之一就是水解三磷酸腺苷（ATP），建立跨膜质子电化学梯度，从而驱动物质的主动转运［4］。

对V-ATP酶（V-ATPase）的研究表明：组成V-ATPase的c亚基参与质子通道的形成，并负责质子的转运［5－6］。由此，推测V-ATPase的c亚基与矿质元素转运直接相关。文献［7］将播种于1／2 MS液体培养基中的7 d龄拟南芥，移栽在1／200 MS培养基中，发现其16 kD c亚基的mRNA水平有所增加，证实了上述质子泵c亚基与矿质营养直接有关的推测。结果提示：矿质营养与质子泵c亚基基因的表达调控有关。然而，有关其可能机制尚不清楚。

本文克隆了编码拟南芥质子泵c亚基基因的3个调控序列（VHA-c），通过其在转基因烟草叶片内的表达，试图探讨矿质营养对VHA-c的可能调节机制。

1 材料与方法

1.1 植物材料

普通栽培烟草（Nicotiana tabacum）：革新一号。转VHA-c2-GUS基因烟草、转VHA-c3-GUS基因烟草和转VHA-c5-GUS基因烟草均由内蒙古农业大学植物分子生物学实验室提供。

1.2 培养基

I0：蒸馏水＋0.7%琼脂＋3%蔗糖（pH5.8，不含任何生长调节物质）。

I1：MS（无Ca2＋）＋0.7%琼脂＋3%蔗糖（pH5.8，不含任何生长调节物质）。

I2：MS＋0.7%琼脂＋3%蔗糖（pH5.8，不含任何生长调节物质）。

在I0、I1和I2培养基中，0.7%琼脂是指在100 mL培养基中添加0.7 g琼脂，3%蔗糖是指在100 m L培养基中添加3 g蔗糖。

1.3 试验处理

在无菌状态下将野生型烟草叶片分别置于I0、I1和I2培养基中，25℃普通光照条件下培养2 h，作为对照1；在无菌状态下将转基因烟草叶片置于I2培养基中，25℃普通光照条件下培养2 h，作为对照2；处理时，在无菌状态下将转基因烟草叶片分别置于I0和I1培养基中，25℃普通光照条件下培养2 h后，用50 mmol／L pH7.0磷酸钠缓冲液冲洗3次。按荧光检测法检测GUS表达活性。

2 结果分析

2.1 Ca2＋对VHA-c-GUS基因表达的调节

普通MS培养基中含有3.41 mmol／L（440 mg／L CaCl2·H2O）Ca2＋［7］。将转VHA-c-GUS基因烟草在含有Ca2＋与不含Ca2＋的MS培养基中培养2 h后，比较了其GUS表达活性。表1为Ca2＋处理下VHA-c-GUS表达水平的显著性检验。表1结果表明：VHA-c-GUS基因的表达水平与Ca2＋有关，表现为VHA-c2和VHA-c3被Ca2＋促进表达，而VHA-c5则被Ca2＋抑制表达，这说明VHA-c基因可被Ca2＋调控表达。尽管如此，显著性检验结果却表明Ca2＋对VHA-c表达的调节作用并不显著。

表1 Ca2＋处理下VHA-c-GUS表达水平的显著性检验

2.2 MS培养基对VHA-c-GUS基因表达的调节

将转VHA-c-GUS基因烟草叶片分别培养在MS培养基和不含任何营养成分的培养基中，也发现其GUS表达水平的明显差异（见表2）。从表2可见：VHA-c2、VHA-c3和VHA-c5均可被MS促进表达，与无任何营养成分的培养条件相比，分别提高了2.39倍、2.58倍和8.50倍。这说明VHA-c基因的表达受MS营养的调节。

表2 MS培养基处理下VHA-c-GUS表达水平的显著性检验

3 讨论

3.1 营养处理与GUS检测本底

对野生型烟草叶片进行Ca2＋和MS营养成分培养处理后，其GUS检测本底如表3所示。研究结果表明：MS营养成分的有无对GUS本底的影响微小，而无Ca2＋条件下GUS本底却显著升高（见表3）。这与文献［8］认为的某些二价金属离子能抑制GUS活性的观点一致。然而，野生型烟草叶片中不存在GUS酶。而且无任何营养成分的培养处理也未能提高GUS的本底。推测这与离子强度不同引起的细胞内容物的变化有关。

表3 Ca2＋和MS营养成分处理下GUS检测本底的显著性检验

3.2 Ca2＋和MS营养成分对VHA-c基因表达的调节及其可能机制

试验结果表明：VHA-c2和VHA-c3可被Ca2＋促进表达，而VHA-c5表达则被Ca2＋抑制。同时，MS营养成分可显著促进VHA-c2、VHA-c3和VHA-c5基因的表达。说明VHA-c基因可被Ca2＋和MS等营养成分调控表达。与文献［9］认为的拟南芥V-ATPase c亚基编码基因的表达与营养成分有关的结果是一致的。然而，文献［9］的研究结果认为：低营养供应促进了拟南芥V-ATPase c亚基编码基因mRNA的累积，这与本文无营养成分下VHA-c基因表达量显著低于MS营养条件的结果正好相反。其原因可能主要有3点：首先，本文研究的是MS和无营养的2种较为极端的情况下的VHA-c基因的表达情况。而文献［9］则研究的是1／2 MS和1／200 MS的培养条件。其次，本文研究的是拟南芥V-ATPase c亚基编码基因的调控序列，而文献［9］研究的是拟南芥V-ATPase c亚基编码基因。另外，拟南芥V-ATPase c亚基是多基因编码的基因家族，现已证实存在至少4种高度同源的编码基因，文献［9］研究的是其编码基因的AVA-P1、AVA-P2和AVA-P3。本文研究的是VHA-c2、VHA-c3和VHA-c5。由此可见，有必要设置无MS和MS营养供应的梯度试验。由此推测：VHA-c3可能被低营养促进表达。

关于Ca2＋对VHA-c的作用机制，可能与Ca2＋／H＋反向传递体有关。已有大量的研究结果表明：植物液泡膜上存在Ca2＋／H＋反向传递体［10－11］。另外，目前的研究普遍认为Ca2＋是一种信号物质［12－13］，而pH也被认为是植物逆境信号的一部分［14－17］，有研究表明：植物逆境的pH变化与质子泵直接有关［17］，由此推测，Ca2＋对VHA-c的作用机制可能与信号系统有关。

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Q945.78

A

1672－6871（2014）05－0079－03

国家自然科学基金项目（30460018）

张春霖（1978－），女，内蒙古呼和浩特人，讲师，硕士，研究方向为植物生物化学与分子生物学；王瑞刚（1972－），男，通信作者，内蒙古赤峰人，教授，博士后，博士生导师，研究方向为植物生物化学与分子生物学.

2013－03－22