蓖麻毒素气源感染小鼠后炎性因子的定量分析

郑关雨，王全凯，王 蒙，钱 军，刘林娜

（1.吉林农业大学动物科学技术学院，吉林 长春 130118；2.军事医学科学院军事兽医研究所，吉林 长春 130122；3.吉林省人兽共患病预防与控制重点实验室，吉林 长春 130122）

蓖麻毒素气源感染小鼠后炎性因子的定量分析

郑关雨1，2，王全凯1，王 蒙1，2，钱 军2，3，刘林娜2，3

（1.吉林农业大学动物科学技术学院，吉林 长春 130118；2.军事医学科学院军事兽医研究所，吉林 长春 130122；3.吉林省人兽共患病预防与控制重点实验室，吉林 长春 130122）

蓖麻毒素会引起机体内蛋白合成终止和细胞凋亡，通过测定组织器官内细胞因子的表达情况可监测机体中毒后免疫应答反应的发生与发展。本试验以气溶胶的方式将蓖麻毒素感染给小鼠，采用荧光定量聚合酶链式反应对攻毒后小鼠的肺脏、脾脏及胸腺中的6种炎性因子进行定量分析。研究结果显示：与对照组（生理盐水组）相比，试验组（蓖麻毒素组）小鼠肺脏、脾脏、胸腺中的趋化因子（CCL2、CXCL2）、白介素2（IL-2）和γ干扰素（INF-γ）的信使RNA（mRNA）表达均显著升高；而白介素1（IL-1）的信使RNA（mRNA）在肺脏、脾脏中高表达，在胸腺中为低表达；白介素4（IL-4）的信使RNA（mRNA）在肺脏、胸腺中高表达，在脾脏中为低表达。由此可知：经毒素气源感染后的小鼠，肺组织及免疫器官组织炎性因子分泌水平发生显著改变，局部及整体免疫调节机能紊乱。

蓖麻毒素；炎性因子；荧光定量聚合酶链式反应；小鼠

0 引言

蓖麻毒素是存在于蓖麻籽中的高效核糖体失活蛋白［1］。国际卫生组织将蓖麻毒素归类为疾病控制的B类管制品。蓖麻毒素对于哺乳动物细胞具有强毒性［2］，可诱发机体细胞分泌多种炎性因子致使机体多器官损伤，这种现象被称为“细胞因子风暴”。在免疫系统中，细胞因子介导和调节天然免疫与适应性免疫反应，比如炎症反应、病原微生物感染、过敏反应、肿瘤细胞毒效应等［3］。当机体发生疾病时，细胞因子表达水平必然会发生一定程度的异常，促使疾病的转归或加剧。所以，监测某些细胞因子的变化对于与之相关疾病的预防、诊断、治疗都具有积极的意义。细胞因子的信使RNA（mRNA）可在蛋白的转录阶段指示细胞因子的分泌情况，常用于分析机体局部或整体的免疫程度。细胞因子的实时荧光定量聚合酶链式反应（QRT-PCR）是近几年发展起来的一项免疫毒理学评价方法。在国外已有针对蓖麻毒素中毒后对肺部细胞因子检测的报道［4］，但国内相关报道尚少。

本试验以SYBR GreenⅠ为双链DNA染料检测聚合酶链式反应（PCR反应）中新核酸链的生成，βactin为内参，比较定量△△CT法［5］分析数据，相对定量，比较生理盐水气溶胶感染组与蓖麻毒素气溶胶感染组中肺脏、脾脏、胸腺之间两种趋化因子、4种细胞因子表达水平差异，在核酸水平上为蓖麻毒素气溶胶粒子对小鼠机体的免疫毒性作出评价。

1 试验材料与方法

1.1 材料

蓖麻毒素（本实验室提供）；雌性BABL／c小鼠（吉林省长春市宏达实验动物中心）；Trizol（Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA）；反转录试剂盒（EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperAE301，Transgen）；荧光定量试剂盒（TransStart Top Green qPCRSuperMix，AQ131，Transgen）；荧光定量PCR仪（ABISTEPONEPLUS）；气溶胶发生器（TSI3079，美国）；引物由鼎国生物技术公司合成。

1.2 小鼠攻毒及组织RNA提取

将浓度为100μg／mL的蓖麻毒素溶液通过气溶胶的方式持续感染小鼠30 min，感染48 h后，取小鼠的肺脏、脾脏和胸腺。组织经液氮充分研磨，取适量，采用Trizol法提取组织RNA。利用EasyScript First-Strand cDNA Synthesis Super（Transgen，AE301）反转录试剂盒将提取的总RNA中的mRNA反转录为cDNA。

1.3 荧光定量聚合酶链式反应（QRT-PCR）

利用荧光定量聚合酶链式反应试剂盒，采用两步法qPCR检测cDNA目的基因表达量。25μL反应体系，40个循环，β-actin为内参，比较定量法Quantitation-Comparative CT（△△CT）法，经软件（StepOne Software v2.1）分析，以相对量差异值（RQ）反映目的基因表达量相对变化情况。

2 结果

2.1 气溶胶暴露后小鼠肺脏、脾脏、胸腺总RNA电泳

小鼠组织细胞为真核细胞，其总RNA被提取后经琼脂糖凝胶电泳可出现3条带，分别为真核细胞核糖体28S、18S、5S（S为沉降系数）亚基的核糖体RNA（rRNA）；本试验成功提取了小鼠肺脏、脾脏、胸腺组织的总RNA（见图1）。

图1 气溶胶暴露后小鼠肺脏、脾脏、胸腺总RNA电泳

2.2 qPCR条件的优化及产物的鉴定

经过反复试验确定β-actin（持家基因，内参）、趋化因子CCL2、CXCL2、白介素1（IL-1）、白介素2（IL-2）、白介素4（IL-4）、γ干扰素（INF-γ）最佳QRT-PCR条件，得到各基因扩增曲线及溶解曲线，部分结果见图2。从各个基因扩增曲线可知：内参基因β-actin与6种细胞因子基因有相似的扩增效率（不同基因扩增曲线相互之间皆呈平行趋势），这是△△CT分析法成立的前提；所有溶解曲线皆为单峰，且在80～90℃（见图2），扩增产物经琼脂糖核酸电泳鉴定皆为100～150 bp，单一条带（见图3），说明扩增条件下反应的特异性良好。

图2 小鼠肺脏、脾脏、胸腺中持家基因β-actin及趋化因子CCL2的扩增曲线及溶解曲线

2.3 气溶胶暴露后小鼠肺脏、脾脏、胸腺中6种细胞因子的实时荧光定量PCR检测结果

表1为气溶胶暴露后小鼠肺脏、脾脏、胸腺中6种细胞因子的实时荧光定量PCR检测结果，由表1可见：试验组与对照组小鼠肺脏、脾脏和胸腺中6种基因表达水平差异均发生显著变化，除脾脏中的白介素4（IL-4）和胸腺中的白介素1（IL-1）较对照组相比低表达外，其余炎性因子的表达量均高于对照组。试验中将各对照组RQ值（RQ值是经过数学公式变形而来，它是判定试验样品中目标靶位点与在标准样品中相同靶位点的表达变化情况）统一为1，其中，肺组织中的趋化因子CCL2、CXCL2的表达量与对照组相比分别高出195.3倍和310.2倍；脾脏中的趋化因子CXCL2和γ干扰素（INF-γ）的表达量较对照组分别高出10.0倍和36.8倍；胸腺中的两种趋化因子CCL2与CXCL2的表达量为对照组的12.0倍和17.0倍。其他炎性因子的表达量较对照组相比要高出2～10倍。

图3 小鼠持家基因β-actin及6种细胞因子扩增结果鉴定

表1 气溶胶暴露后小鼠肺脏、脾脏、胸腺中6种细胞因子的实时荧光定量PCR检测结果

3 讨论

蓖麻毒素是一类核糖体失活蛋白，它能够与28S核糖体中的RNA结合脱去核糖体上的腺甘酸，破坏核糖体引起细胞死亡［6］。蓖麻毒素具有强毒性，中毒后病理反应明显，病程较短，并迅速导致多器官损伤。已有报道表明小鼠中毒后多个器官发生炎症、出血性坏死［7］。其原因一方面可能是由于蓖麻毒素直接作用于机体细胞，引起细胞蛋白质生成障碍、过氧化损伤及凋亡［8］。同时，也有可能是蓖麻毒素激发机体神经－内分泌－免疫调节机制，炎性因子过度高表达或低表达，引起机体发热、炎症及广泛性毛细血管渗漏综合症［9］。

多种多样的细胞因子，通过调节网络，在机体内相互促进或者相互制约，发挥着多种生物学功能［10］。机体在防御、清除“异物”时，相关细胞会分泌具有定向细胞趋化作用的小分子蛋白—趋化因子。本试验所选取的趋化因子（CCL2／CKCL2），白介素（IL-1、IL-2、IL-4），γ干扰素（INF-γ）皆与肺部炎症及免疫调节有关，但其各自的分泌调控机制又有着复杂的特殊性［11］。

从本试验结果可看出：中毒后小鼠体内肺部、脾脏、胸腺炎性因子表达发生显著改变，局部及整体免疫调节机能紊乱。文献［12］曾针对蓖麻毒素暴露后小鼠肺部的细胞因子表达情况进行了研究，提示蓖麻毒素能够引起肺部的细胞因子风暴，本试验添加了两种免疫器官，将整个机体作为研究对象。试验中趋化因子CCL2、CXCL2、白介素2（IL-2）、γ干扰素（INF-γ）在肺部、脾脏、胸腺均高表达，从基因表达水平说明肺部、脾脏、胸腺发生严重炎症反应，而且较偏重于Th1介导的细胞免疫。这可能是由于蓖麻毒素抑制细胞蛋白表达，引起细胞过氧化反应，使免疫细胞损伤、变性及凋亡，以至于免疫调节网络紊乱。在众多细胞因子高表达的情况下，脾脏白介素4（IL-4）低表达，胸腺的白介素1（IL-1）低表达，可能与免疫器官所主导的功能相关。脾脏及胸腺在小鼠中毒后萎缩明显，细胞功能下降，免疫细胞损伤严重，可推测机体中毒后引发机体神经－内分泌－免疫调节机制，中枢免疫器官胸腺的免疫细胞生成，外周免疫器官脾脏的免疫细胞活化皆受到反馈性调节，抑制由于蓖麻毒素的呼入引发的免疫亢进，以维持稳态。但从整体多数细胞因子高表达来看，此时机体整体稳态已经处于失代偿状态。

［1］ Amanda E J，Cheng JS，Li X P，et al.A Relatively Low Level of Ribosome Depurination by Mutant Forms of Ricin Toxin a Chain Can Trigger Protein Synthesis Inhibition，Cell Signaling and Apoptosis in Mammalian Cells［J］.The InternationalJournal of Biochemistry＆Cell Biology，2012，44（12）：2204－2211.

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S852.44

A

1672－6871（2014）02－0074－04

国家“863”计划基金项目（2012AA022006）；国家自然科学基金项目（31101858）

郑关雨（1988－），女，辽宁营口人，硕士生；王全凯（1958－），男，辽宁庄河人，教授，博士生导师，研究方向为经济动物疫病防治；刘林娜为通信作者.

2013－10－11