牛黄清感胶囊对呼吸道合胞病毒体外预防作用的实验研究

周有财 常 洋 王玉莹

(黑龙江澳利达奈德制药有限公司，黑龙江 庆安 152400)

牛黄清感胶囊对呼吸道合胞病毒体外预防作用的实验研究

周有财 常 洋 王玉莹

(黑龙江澳利达奈德制药有限公司，黑龙江 庆安 152400)

检测牛黄清感胶囊对呼吸道合胞病毒(RSV)的预防的作用，为抗病毒药物的筛选、研发提供实验依据。在VERO细胞培养内，采用病毒细胞形态变化CPE法、MTT染色法，检测不同浓度的牛黄清感胶囊对呼吸道合胞病毒(RSV)的预防作用。实验分一次用药组和三次用药组，计算药物的半数有效浓度IC50，最小有效浓度MIC及治疗指数TI。体外抑制和预防呼吸道合胞病毒的药效实验结果显示“牛黄清感胶囊”具有抑制和预防呼吸道合胞病毒的作用。

牛黄清感胶囊；呼吸道合胞病毒；实验研究

1 实验材料

1.1 验证药物：牛黄清感胶囊，国药准字Z20026054，每粒含0.3 g生药，批号091202，生产日期：2009.12.02，由黑龙江澳利达奈德制药有限公司提供。

1.2 阳性药物对照：利巴韦林注射液(病毒唑)，0.1克/支，苏卫药准字（1988）第347003号：批号000223，由苏州第六制药厂生产。

1.3 细胞：非洲绿猴肾传代细胞(VERO)第126-128代，由中国药品生物制品鉴定所提供。

1.4 病毒：呼吸道合胞病毒(RSV)标准毒株Long，批号：19981212，由中国微生物菌毒种保藏管理中心提供。

1.5 生物安全二级实验室，由中国微生物菌毒种保藏管理中心提供。其他器材见表1。

2 实验方法

牛黄清感胶囊对呼吸道合胞病毒(RSV)的预防作用：

2.1 病毒CPE法：①细胞培养：VERO细胞P126-P129代，采用0.05%Trysin-EDTA消化，以40万/毫升的浓度接种96孔培养板，培养基为L-谷氨酸完全型D-MEM、10%的进口特级胎牛血清。37 ℃、5% CO2孵箱培养至细胞对数生长期最旺盛90%成片细胞，弃掉细胞培养液，采用Hank's溶液洗细胞2次。②药物作用细胞：牛黄清感胶囊，选用对细胞的最大无毒浓度（TD0）2倍稀释8个浓度，即750～5.9 µg/mL，同时设利巴韦林注射液阳性药物对照，2倍稀释9个浓度1250～4.9 µg/mL，每浓度接种感染细胞3孔，每孔100 µL。实验分一次用药组（不同浓度的药液作用被病毒感染的VERO细胞1次），三次用药组（不同浓度的药液作用被病毒感染的VERO细胞，每24 h弃掉旧药液，换同浓度的药液，连续3次）。③病毒攻击：将呼吸道合胞病毒(RSV)，采用病毒生长液（D-MEM培养基中含牛血清白蛋白组分12.5 mL、青酶素100 U/mL、链酶素100 µg/mL，HEPES12.5 mL）稀释至40TCID50，接种经药物作用的VERO细胞96孔培养板，每孔100 µL，同时设病毒对照（40TCID50病毒液），设正常细胞对照。37 ℃、5% CO2孵箱中吸附2 h，弃掉病毒稀释液，采用Hank's溶液洗2次。④细胞培养及观察：每孔加入100 µL病毒生长液，37 ℃、5% CO2孵箱培养，每24 h在倒置显微镜下观察细胞形态CPE变化，以25%以下细胞形态CPE变化为“+”，26%～50%细胞形态CPE变化为“++”，51%～75%细胞形态CPE变化为“+++”，76%～100%细胞形态CPE变化为“++++”，至病毒对照出现“++++”时结束实验，用Reed-Muench法，计算药物半数有效浓度（IC50）和最小有效浓度（MIC）及治疗指数（TI）判断药效。实验重复3次。

表1 其他器材

表2 不同浓度“牛黄清感胶囊”体外预防呼吸道合胞病毒(RSV)药效实验结果

2.2 病毒MTT染色法：观察细胞病变CPE结果后，加入MTT 5 mg/mL，每孔10 µL，置37 ℃培养4 h，然后加入100 µL DMSO有机溶剂，室温20 min，充分溶解细胞（过程中稍加震荡）。然后，采用酶标仪波长570 nm测定，记录OD值，计算药物半数有效浓度IC50和最小有效浓度MIC及治疗指数TI，判断药效。实验重复3次。

3 结 果

牛黄清感胶囊体外预防呼吸道合胞病毒(RSV)药效实验结果：在VERO细胞培养内，采用病毒细胞形态变化CPE法、MTT染色法，检测不同浓度的牛黄清感胶囊对呼吸道合胞病毒(RSV)的预防作用。实验分一次用药组和三次用药组，计算药物的半数有效浓度IC50，最小有效浓度MIC及治疗指数TI。三次实验结果见表2。

4 讨 论

呼吸道合胞病毒是呼吸道感染常见的致病原因之一，患者的主要临床表现为咳嗽、喘息、气促，病情严重时可出现严重的心力衰竭，甚至威胁生命安全[1]。临床上6个月以内婴儿的毛细支气管炎以及年幼儿RSV肺炎可威胁生命。除年龄外，其他高危因素如先天性心脏病伴有肺动脉高压或慢性肺疾患、早产、早产伴支气管肺发育不良均可增加RSV感染的严重度和病死率。另外，RSV感染引起的毛细支气管炎与儿童反复喘息密切相关，也是儿童哮喘急性发作的重要诱因[2]。我们对呼吸道合胞病毒的实验结果表明“牛黄清感胶囊”经在非洲绿猴肾传代细胞上，进行呼吸道合胞病毒体外抑制和预防药效实验，结果显示，不同浓度的“牛黄清感胶囊”能够抑制此病毒的繁殖。

[1] 丰力.更昔洛韦治疗呼吸道合胞病毒肺炎的疗效观察[J].实用药物与临床,2012,l5(5):317-318.

[2] 朱秋皎,刘继贤.呼吸道合胞病毒肺炎患儿TLR4及IFN-γ临床观察[J].天津医药,2012,40(7):738-739.

R282.720.7

B

1671-8194（2014）29-0068-02