多功能阳离子脂质体跨血脊髓屏障的实验研究

高仕杰 刘 洋

（天津医科大学总医院骨科，天津 300052）

多功能阳离子脂质体跨血脊髓屏障的实验研究

高仕杰 刘 洋

（天津医科大学总医院骨科，天津 300052）

目的探讨异硫氰酸荧光素（FITC）标记阳离子脂质体通过尾静脉注入后，跨越大鼠血脊髓屏障并在局部聚集的情况。方法30只成年Wistar大鼠随机等分为3组，每组10只，荧光显微镜动态观察脂质体在中枢神经系统（CNS）中靶向聚集与扩散情况，通过组织学观测进一步分析其与CNS细胞的关系。结果相同浓度下（75～600 μg/mL），TAT-PEG-阳离子脂质体较未经TAT修饰者具更低细胞毒性，且更易被MCF-7细胞摄取；FITC标记TAT-PEG-阳离子脂质体可跨越BSCB并聚集，低倍镜下观察到许多荧光微粒聚集于CNS组织，高倍镜形象地显示出荧光微粒位于神经细胞内。结论经跨膜肽（TAT）、聚乙二醇（PEG）修饰的阳离子脂质体具有良好的生物相容性与靶向定位特性，可跨过BSCB，聚集于CNS细胞中，安全用作药物载体，为中枢神经系统疾病的治疗提供新的途径。

阳离子脂质体；异硫氰酸荧光素；血脊髓屏障

目前，中枢神经系统（central nervous system，CNS）疾病的治疗仍为医学界面临的一大难题，药物依然是治疗此类疾病最为可靠的方法[1-2]。然而，由于血脊髓与血脑屏障中内皮细胞紧密连接的存在，大分子药物很难通过，限制了其发挥有效作用。许多研究探讨过解决此问题的方法[3-8]，但无一结果令人满意。因此，我们需要寻找一类更为有效的药物运载方式。脂质体作为一种纳米载体，能够扩散至内皮细胞膜内，并依靠被动运输进入中枢神经系统。而单纯脂质体水溶性低，需要对其进行进一步修饰。

研究表明，表面连接TAT可增强脂质体跨越血脑屏障的能力。有学者已证明了经TAT修饰的微粒能够携带抗生素经过血脑屏障以治疗急性细菌性脑炎[9-10]。本实验使用FITC标记制备的TAT-PEG-阳离子脂质体，使其兼具跨膜、长循环及荧光示踪功能，经尾静脉将其注入大鼠体内，旨在分析此新型脂质体跨越血脊髓、血脑屏障的能力，为中枢神经系统疾病的治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物：健康成年雄性Wistar大鼠30只（8周龄），体质量（220±10）g，中国医学科学院放射医学研究所提供。

1.1.2 主要仪器：眼科手术器械（新华手术器械厂），荧光显微镜（OLYMPUS BX-60，Japan），透射电子显微镜（JEOL-100CXII，日本电子光学公司），激光粒度分析仪及zeta电位分析仪（Malvern Instruments Ltd.，U.K.），电子天平（JA-2003，上海），切片机（LEUCER，USA）。

1.1.3 主要试剂：PEG-阳离子脂质体、TAT-PEG-阳离子脂质体、FITCTAT-PEG-阳离子脂质体（天津大学材料学院纳米生物技术研究所），高糖DMEM培养液（Solarbio公司，天津鼎国生物技术有限责任公司代理）、胎牛血清（GIBCO公司，USA）：将上述两种试剂按9∶1配制成含10%FBS的DMEM培养液作为培养基供MCF-7细胞培养用，MTT（四甲基偶氮唑盐）（Genview公司）：用0.01 mol/L PBS（pH 7.0）配成5 mg/mL，4 ℃避光保存，二甲基亚砜（天津市化学试剂三厂，分析纯）。

1.2 实验方法

1.2.1 动物饲养：于温度20～23 ℃，湿度50%～70%，照度200勒克斯（12-h light and 12-h dark cycle），噪音60分贝，通风条件（10～15次/小时）下饲养动物，自由进食水。

1.2.2 细胞培养：MCF-7人乳腺癌细胞（南开大学生命科学学院提供）在含12%新生小牛血清的RPMI-1640培养基中培养，置于37 ℃、95%湿度、5%CO2培养箱中。每1～2 d换液1次，每2～3 d传代1次，取对数生长期的细胞用于实验。

1.2.3 FITC -TAT-PEG-阳离子脂质体的测定：通过透射电子显微镜观察FITC-TAT-PEG-阳离子脂质体的形态学特征；平均粒径、粒径分布与zeta电位通过激光粒度分析仪及zeta电位分析仪进行分析。

1.2.4 脂质体体外毒性试验：胰酶消化对数期MCF-7细胞，终止后离心收集，制成细胞悬液，调整其浓度至（5～10）×104/mL。接种于96孔板，1次加6孔，每孔100 μL（边缘孔用无菌PBS填充）。将接种好的细胞培养板放入培养箱中，5%CO2、37 ℃孵育，贴壁生长约24 h，至细胞单层铺满孔底。加入不同浓度梯度药物，每孔100 μL，每个梯度设6个复孔。5%CO2、37 ℃孵育4、12、24、48 h。而后每孔加入20 μLMTT溶液（5 mg/mL，即0.5%MTT），5%CO2、37 ℃孵育培养4 h，滤纸吸去上清，溶解结晶。无菌0.01 mol/L PBS洗1～2次。每孔加入150 μL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min。在酶联免疫检测仪OD570 nm处测量各孔的吸光值，用620 nm作参考波长。计算各浓度细胞存活率，公式如下：细胞存活率%=（实验孔OD值-调零孔OD值）/（对照孔OD值-调零孔OD值）×100%。

1.2.5 细胞摄取脂质体情况分析：将MCF-7细胞接种于6孔板上（密度1 ×104/孔）。一天后，分别加入FITC-TAT-PEG-阳离子脂质体、FITCPEG-阳离子脂质体及FIFC悬液。于5 s，10 s，4 min，30 min，1 h，24 h后，分别移去介质，PBS液（0.01mol/L）漂洗2次，每次5 s。而后使用荧光封固剂将盖玻片固定于清洁载玻片上，使用荧光显微镜观察细胞。同时，将细胞置于PBS液中（20 µg/mL）进行PI染色以观察细胞核形态。

1.2.6 CNS摄取脂质体的体内分析：将30只成年Wistar大鼠随机等分为3组：单纯FIFC悬液对照组（A组）、FITC-PEG-阳离子脂质体组（B组）、FITC-TAT-PEG-阳离子脂质体组（C组），每组10只，均通过尾静脉将溶液注射于大鼠体内，剂量为4.55 mg/kg。注射后第1、4、8、12及24 h，分别以10%水合氯醛腹腔注射处死大鼠，快速取出其脑与脊髓组织存于液氮中。随后，将组织置于-80 ℃条件下24 h，而后置于-20 ℃环境中。制作大脑与脊髓前后轴的冠状位冰冻切片（厚度10 mm），使用包含DAPI的荧光封固剂将其固定于玻片上以进行细胞核染色。使用荧光显微镜观察标本。

1.2.7 组织学分析：制作中枢神经系统组织冰冻切片（厚度30 mm），PBS液漂洗，使用包含PI的荧光封固剂将其固定于玻片上以进行细胞核染色。同时，制作厚度为5 mm冰冻切片进行HE染色。使用荧光显微镜与光学显微镜观察标本。

1.2.8 统计学分析：实验数据以（χ-±s）的形式表示，采用SPSS 13.0统计软件（SPSS公司，美国）进行统计学分析。P＜0.05被认为具有统计学意义。

2 结 果

2.1 脂质体平均粒径、粒径分布与zeta电位值：利用反相蒸发法制备的FITC-TAT-PEG-阳离子脂质体见图1～3。可见阳离子脂质体分散性较好，呈球形，粒径多在100 nm以下。粒度分析仪测得的平均粒径为85.9 nm，粒径分布范围在80～100 nm，粒径分布指数为0.179（图4a）。zeta电位值为（29.57±3.47）mV（图4b）。

2.2 细胞毒性比较：MCF-7细胞与不同浓度的脂质体共培养4、12、24、48 h后，生存率见图5、表1。与600 μg/mL浓度的TAT-PEG-脂质体共培养48 h后，细胞存活率为（61.84±3.34）%，而与PEG-脂质体共培养细胞存活率<50%。细胞存活率随脂质体浓度的增加而逐渐降低。

2.3 细胞摄取脂质体情况：MCF-7细胞与FITC-TAT-PEG-脂质体共培养一段时间后，可在胞内观察到密集荧光。TAT-PEG-脂质体跨膜典型的时间依赖性见图6、7。5 s后，FITC-TAT-PEG-脂质体组、FITC-PEG-脂质体组中细胞膜周围出现荧光。10 s后，荧光更为明显，然而，大部分仍位于细胞膜外而未进入胞内。3＇30＂后FITC-TAT-PEG-脂质体组的胞膜与胞质中均可观测到荧光。4 min后，荧光出现于细胞内，但仍位于细胞核外。1 h后（1～24 h）荧光均位于细胞内，两组分布无差别。

2.4 CNS中脂质体聚集情况：于尾静脉注射4 h后发现，较脊髓与脑组织中其他区域，荧光更多集中于毛细血管，表明脂质体由毛细血管进入周围组织（图9a1、b1）。此外，由于灰质血供丰富，脂质体主要聚集于此，白质中几乎没有出现（图9c1、d1）。低倍镜下可观察到许多荧光微粒聚集于CNS组织；高倍镜亦可形象显示出荧光微粒位于神经细胞内（图8，白色箭头）。通过比较HE与荧光染色，可知CNS中荧光微粒与细胞的关系（图9），相同结果亦在注射1 h与24 h后观察到，这很大程度上取决于PEG的长时间循环特性。

图1 反向蒸发法制备脂质体流程图

图2 FIFC-TAT-PEG-阳离子脂质体结构示意图

图3 FIFC-TAT-PEG-阳离子脂质体透射电镜图，可见该脂质体呈球形，粒径分布较均匀，脂质体粒径＜100 nm

图4 FIFC-TAT-PEG-阳离子脂质体粒径分布及zeta电位值，有效粒径大小约为85.9 nm（a），平均电位在（29.57± 3.47）mV，具有较好的分散性及稳定性

图5 与脂质体共培养的MCF-7细胞生存率，图a示与非TAT修饰脂质体共培养4、12、24、48 h后MCF-7细胞体外生存率；图b示与TAT修饰脂质体共培养4、12、24、48 h后MCF-7细胞体外生存率

图6 荧光显微镜下观察MCF-7细胞与FITC-TAT-PEG-阳离子脂质体、FITC-PEG-阳离子脂质体、单纯FITC共培养情况分别如图a、b、c所示

图7 37 ℃下，与FITC-TAT-PEG-阳离子脂质体共培养24 h，高倍镜观察MCF-7细胞如图所示，细胞核经PI染色，图a为FITC荧光细胞显像，图b为PI染色后细胞核显像，图c为a、b重叠像

图8 大鼠尾静脉注射FITC-TAT-PEG-阳离子脂质体4 h后，脊髓与脑组织冰冻切片经荧光显微镜（a）、亮场显微镜（b）观察结果如图所示,c为a、b重叠像，箭头示荧光微粒聚集于脊髓和脑组织神经细胞中

3 讨 论

脂质体与带负电荷的细胞膜产生静电作用而导致细胞毒性，这与其数量、浓度、阳离子分布相关。聚合物相对分子质量和电荷密度的增加会造成细胞膜的损伤，甚至细胞死亡。本实验用MTT法检测MCF-7细胞与脂质体共培养后的存活率，该法简便、快速，且能较客观地反映细胞相对存活情况，在细胞毒性实验中应用广泛。结果显示，与低密度TAT-PEG-阳离子脂质体共培养的细胞具有较高生存率，表明新型脂质体具有良好的生物相容性，在相对安全剂量范围内（75 μg/mL）并不影响细胞存活率，故新型脂质体可安全用作药物载体。分析其原因，主要是因为TAT修饰的脂质体以更多数量迅速进入MCF-7细胞内，减少了带正电荷的脂质体在细胞外的蓄积。未经TAT修饰的脂质体只有较少量进入细胞内，造成过多正电荷在胞外蓄积。

表1 与不同浓度脂质体体外共培养不同时间后MCF-7细胞生存率（n=10）

图9 大鼠尾静脉注射FITC-TAT-PEG-阳离子脂质体4 h后，高倍镜观察CNS神经细胞中荧光微粒分布如图所示，细胞核经DAPI染色

最近研究表明[11-13]，TAT通过巨胞饮，一种内吞形式完成内化过程，为此类多肽的研究提供了新的依据。TAT介导的内化过程主要包含三个步骤：首先为依靠细胞表面广泛存在的多糖链与胞体表面结合；而后TAT可能通过结合细胞表面蛋白或蛋白聚糖、糖脂途径激活巨胞饮作用[14]，与细胞表面阴离子多聚糖链，如硫酸肝素结合，在内化过程中起着关键作用，这种结合可促进其进入巨胞饮体；最后从巨胞饮体中脱出进入胞质，这很大程度上依赖于胞内PH值，TAT干扰了膜的稳定性，从而进入细胞质中。

FITC是一种常用的绿色荧光探针，是目前应用最广泛的荧光素。本实验用FITC标记TAT-PEG-阳离子脂质体，可清晰显示其在MCF-7细胞内外的情况。实验结果表明FITC-TAT-PEG-阳离子脂质体较未经TAT修饰者能够更快、更有效地进入MCF-7细胞中。由此可知，TAT具有促进细胞摄入脂质体的功能，FITC-TAT-PEG-阳离子脂质体可以有效结合于MCF-7细胞表面并进入胞内。而且细胞荧光显像发现，TAT介导的阳离子脂质体不仅进入细胞质，而且进入细胞核，这就为基因转染提供了较多可能性。

实验中，在尾静脉注射脂质体后1～24 h区间内，实验组可在CNS神经细胞内及其周围观测到荧光，这说明FITC-TAT-PEG-阳离子脂质体不仅能跨过血脊髓屏障与血脑屏障，而且能够穿越细胞之间的组织到达临近细胞，这与我们之前所做FITC-TAT-PEG-阳离子脂质体与MCF-7细胞共培养的实验结果相一致。实验也证明未经TAT修饰的脂质体跨CNS屏障能力有限，单纯FITC不能跨过血脊髓、血脑屏障。原始脂质体依被动扩散跨血脊髓、血脑屏障，此机制受CNS损伤处的多种条件限制，如pH值、颗粒直径、相对分子质量等。将PEG包绕于脂质体表面，可减少血浆蛋白的黏附作用，避免单核巨噬细胞对脂质体的快速识别[15]，减少RES摄入，延长其循环时间。作为跨膜肽，TAT能够诱导内吞泡的形成，并通过类似AMT机制引起质膜的内吞作用。实验证实，将PEG、TAT与脂质体相结合，能够使其最大程度地跨越血脊髓、血脑屏障并聚集于受损局部，以更为有效地发挥所承载药物的作用，使之有望成为中枢神经系统疾病治疗的有力工具。

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Fitc Loaded Tat-Peg-Modified Liposomes Cross the Blood-Spinal Cord and the Blood-Brain Barriers

GAO Shi-jie, LIU Yang
(Department of Orthopaedics, General Hospital of Tianjin Medical University, Tianjin 300052, China)

ObjectiveTo observe the ability of fluorescein isothiocyanate(FITC) loaded transactivating-transduction protein(TAT)-polyethylene glycol(PEG)-modified liposomes crossing the blood-spinal cord barrier(BSCB) of rats, then localizing there after injection of caudal veins.MethodThirty rats were divided into three groups. Rats were injected with liposome solution (4.55 mg/kg) via the caudal vein. Using fluorescence microscope and histological methods to analyse.ResultsAt the same concentration(75-600 μg/mL), TAT-modified liposomes had lower cytotoxicity, and were more easily uptaken by MCF-7 cells than the ones without TAT. We observed that TAT-modified liposomes crossed the BSCB, accumulated in CNS tissue and aggregated into cells there by microscope.ConclusionTAT-PEG-modified liposomes have the characteristics of bio-compatibility and targeting. They can cross the BSCB acting as a drug carrier and accumulate in CNS tissue for future CNS disease treatment.

Liposome; Fluorescein isothiocyanate(FITC); Blood-spinal cord barrier(BSCB)

R741.04

B

1671-8194（2014）34-0045-03