旋链角毛藻对中肋骨条藻化感作用的影响因素及化感物质性质初探

张议文，王江涛*，谭丽菊

（1.中国海洋大学海洋化学理论与工程技术教育部重点实验室，山东青岛，266100）

旋链角毛藻对中肋骨条藻化感作用的影响因素及化感物质性质初探

张议文1，王江涛1*，谭丽菊1

（1.中国海洋大学海洋化学理论与工程技术教育部重点实验室，山东青岛，266100）

在已知旋链角毛藻对中肋骨条藻具有化感作用的前提下，进行了温度、生长时期、光照、细菌等因素对旋链角毛藻化感作用的影响、化感物质的萃取及粗提物对中肋骨条藻的化感效应检验等实验，研究了旋链角毛藻化感物质的性质、降解特点，并初步测定了化感物质的结构。结果表明：旋链角毛藻化感作用与生长时期有关，指数期滤液化感作用强于衰亡期；旋链角毛藻的化感物质在50℃以下保持稳定，光和细菌均引起旋链角毛藻化感物质的降解，且细菌降解强于光降解；旋链角毛藻的乙酸乙酯萃取物具有明显的化感活性，该萃取物在255～260 nm处有特征吸收峰。综合以上结果，推测旋链角毛藻化感物质可能为分解温度在50℃以上的易被光和细菌降解的苯衍生物，从极性上看较易溶于乙酸乙酯。

化感物质；旋链角毛藻Chaetoceros curvisetus；中肋骨条藻Skeletonema costatum

1 引言

化感作用是指植物、藻类、细菌、真菌通过次级代谢产物影响生态系统的发展和演变的过程［1］。近年来随着赤潮频发，浮游植物间的化感作用越来越受到研究者的关注。已有很多研究发现浮游植物间存在化感作用，并认为浮游植物通过释放胞外化感物质进行种间竞争是浮游植物群落发展演变及赤潮暴发、优势种演替的原因之一［2－3］。例如Liu等［4］研究发现化感作用是球形棕囊藻对海洋卡盾藻和卵圆褐胞藻获取竞争优势的主要原因。Yamasaki等［5］发现中肋骨条藻滤液抑制赤潮异湾藻的生长，并推测相关的化感物质与中肋骨条藻赤潮中藻类的演替有关。王江涛等［6］发现在营养盐不足条件下，中肋骨条藻滤液会对自身产生抑制作用，化感作用可能影响中肋骨条藻和东海原甲藻的竞争和演替。

化感物质是浮游植物对竞争者产生促进或抑制作用的媒介，在环境胁迫的压力下，化感物质的产生量与释放量会增加，以提高化感作用物种的竞争能力。自然环境中，许多非生物因素和生物因素会影响化感物质的分泌，也干扰化感物质对目标藻的作用，其中，非生物因素主要有光照、p H、温度、营养盐等，生物因素包括细胞密度、生长时期、生物降解过程等［3］。尽管化感作用的研究日益广泛，但是由于很难对滤液中的有效化学物质进行分离和纯化，目前化感物质的性质、结构和功能仍存在很多未知。在前期实验中，我们已发现化感作用是旋链角毛藻抑制中肋骨条藻生长的途径之一，旋链角毛藻通过产生与释放胞外活性物质（即化感物质）到周围水体环境中而获得相比中肋骨条藻更好的生长优势［7］。本文以此为前提，进行了温度、生长时期、光照、细菌等因素对旋链角毛藻化感物质的影响及化感物质的提取实验，研究了旋链角毛藻化感物质的降解特点、性质和初步结构，从而为进一步提取旋链角毛藻化感物质、探讨化感作用机理奠定基础。

2 材料与方法

2.1 微藻培养

实验藻种中肋骨条藻和旋链角毛藻，均取自中国海洋大学海洋污染生态化学实验室藻种室，培养于光照培养箱中，培养温度为（20±1）℃，光暗比为12 h∶12 h，光照度4 000 lx。每天定时摇晃培养瓶并重新随机排放，以排除任何光或温度不同造成的影响。每实验组设3个平行样。

2.2 实验方法

2.2.1 温度对旋链角毛藻化感作用的影响

取旋链角毛藻指数末期的培养液，用0.22μm微孔滤膜过滤，得到无藻细胞滤液。分别置于50℃、90℃水浴中加热半小时，冷却后测定NO3-N，NO2-N，NH4-N，PO4-P，SiO4-Si五项营养盐指标，测定方法分别为锌-镉还原法、重氮-偶氮法、次溴酸钠氧化法、磷钼蓝分光光度法和硅钼蓝分光光度法［8］。已知营养盐浓度的旋链角毛藻无藻细胞滤液和灭菌海水均加富至f／2培养基，接种中肋骨条藻。中肋骨条藻初始藻密度为8×104个／mL，每天定时取样用于CASY细胞仪计数。

2.2.2 生长时期对旋链角毛藻化感作用的影响

分别取旋链角毛藻的指数期和衰亡期培养液，藻密度均为1.9×106个／m L，经0.22μm微孔滤膜过滤得到滤液，测定五项营养盐指标（方法同2.2）后，加富至f／2培养基，以灭菌海水为对照，培养中肋骨条藻。中肋骨条藻初始藻密度为8×104个／m L，每天定时取样用于显微镜计数和Fv／Fm（PSⅡ的最大光化学量子产量）测定。

2.2.3 光和细菌对旋链角毛藻化感作用的影响

取旋链角毛藻衰亡期无藻滤液，分两个实验组，一组避光保存，一组每天定时添加浓度为0.5 mg／L的链霉素、多粘菌素B，另设一实验组为添加同等浓度抗生素的灭菌海水。放置20 d后，测定五项营养盐指标，以新鲜衰亡期滤液和新鲜灭菌海水为对照组，均加富至f／2培养基。中肋骨条藻初始藻密度为8×104个／m L，定时取样用于显微镜计数和Fv／Fm测定。

2.2.4 旋链角毛藻滤液化感物质粗提及粗提物对中肋骨条藻生长的影响

灭菌海水中分别添加1%二甲亚砜（DMSO）、乙醚、乙酸乙酯、正已烷，以灭菌海水为空白对照，按f／2培养基添加营养盐，接种中肋骨条藻，初始藻密度为1.2×105个／m L，每天定时取样用于CASY细胞仪计数。

取指数末期旋链角毛藻滤液，分别用乙醚、乙酸乙酯、正已烷萃取，取有机相旋蒸（加热温度均为45℃以下），经DMSO溶解，用灭菌海水定容至原体积。按f／2培养基添加营养盐，中肋骨条藻初始藻密度为1.2×105个／m L，每天定时取样用于CASY细胞仪计数。

2.2.5 乙酸乙酯提取物的紫外光谱扫描

取指数期旋链角毛藻滤液的乙酸乙酯提取物，在UV2550紫外-可见分光光度计上，进行200～400 nm紫外-可见全光谱扫描，以确定化感物质的特征吸收。

以人工海水作参比，在最大吸收峰处测定旋链角毛藻指数期滤液的吸光度。

2.3 数据处理

2.3.1 相对抑制率（IR）采用下式计算每一天对生物量的相对抑制率［8］：

IR（%）=（1－T／C）×100%，

式中，IR为相对抑制率，T为实验组生物量，C为对照组生物量。

2.3.2 显著性检验

通过每个实验组的平行样计算平均值及标准偏差（n=3）。各组间的显著性差异用one-way ANOVA进行分析［9］。p＜0.05作为显著性差异的标准。

3 结果

3.1 温度对化感作用的影响

旋链角毛藻滤液经50℃、90℃加热处理后，分别测定各项营养盐，由结果可知，加热后滤液中各溶解态营养盐浓度均增加，经90℃加热处理的实验组，与其他两组实验相比，硅酸盐浓度明显增加（见表1）。据已知滤液浓度，将滤液加富至f／2培养基，同时以加富至f／2培养基的灭菌海水为对照组，排除营养盐浓度不同对实验结果的影响，根据中肋骨条藻细胞计数结果，绘制生长曲线（图1）并计算相对抑制率（图2），以研究加热分解对旋链角毛藻的化感作用的影响。

表1 不同热处理条件下旋链角毛藻滤液营养盐浓度

从图1和图2可以看出，50℃加热处理藻液与未处理藻液中，中肋骨条藻藻密度无差异（p=0.87），与海水对照组相比均显示了抑制作用，48 h时抑制率达到最大值，分别为65%和60%。滤液经90℃加热，仍表现有一定的抑制作用，但抑制率小于另外两组，说明经90℃加热处理后，旋链角毛藻滤液中的化感物质部分失活，导致旋链角毛藻对中肋骨条藻的化感作用减弱。而加热至50℃对旋链角毛藻滤液的抑制效果无影响，即50℃时旋链角毛藻化感物质是稳定的。在以后的提取实验中，为保证提取效率，加热温度控制在50℃以下。

图1 中肋骨条藻在不同加热处理的旋链角毛藻滤液中的生长曲线

图2 中肋骨条藻在不同加热处理的旋链角毛藻滤液中的相对抑制率

3.2 生长时期对化感作用的影响

图3显示了在不同生长阶段的旋链角毛藻滤液条件下，中肋骨条藻的生长曲线。添加滤液的两实验组中，中肋骨条藻进入指数期的时间比海水对照组晚，旋链角毛藻的指数期和衰亡期滤液对中肋骨条藻的生长均显示了抑制作用，两实验组的最大抑制率均出现在第60 h，分别为82%和68%。同时，44 h后两组中肋骨条藻藻密度之间有显著性差异（p＜0.05），表明指数期滤液抑制效果强于衰亡期。Fv／Fm的结果（未给出）显示，前70 h，在旋链角毛藻指数期滤液中培养的中肋骨条藻Fv／Fm值小于衰亡期滤液中的Fv／Fm值，且实验组Fv／Fm值显著小于海水对照组，说明中肋骨条藻在旋链角毛藻滤液中的生长受到胁迫，这种作用指数期滤液比衰亡期强。结合中肋骨条藻生长过程中的藻密度与Fv／Fm值结果，可以得出旋链角毛藻指数期及衰亡期滤液对中肋骨条藻的生长均有明显的抑制作用，且指数期滤液的化感作用强于衰亡期滤液。

3.3 光和细菌对旋链角毛藻化感作用的影响

按实验方法2.1对中肋骨条藻进行培养实验，包括海水每天添加抗生素放置20 d组、滤液每天添加抗生素放置20 d组、滤液避光放置20 d组、新鲜滤液组及海水空白对照组，得到中肋骨条藻生长曲线（见图4）。滤液中添加抗生素，可排除细菌对化感物质的影响，避光放置排除了光对化感物质的影响。从图4可以看出，海水添加抗生素组与海水空白对照组中培养的中肋骨条藻，藻密度没有差异（p=0.98），Fv／Fm值（结果未列出）差异也不大（p=0.76），说明每天添加0.5 mg／L的链霉素与多黏菌素B，不影响中肋骨条藻的生长。而滤液添加抗生素组、滤液避光放置组、新鲜滤液组与对照组相比，均抑制中肋骨条藻的生长，培养过程中的平均抑制率分别为30%、13%、57%，即抑制效果为新鲜滤液强于滤液添加抗生素组强于滤液避光放置组。Fv／Fm值结果表明，中肋骨条藻在旋链角毛藻新鲜滤液中受到的生长胁迫作用最明显，其次是在添加抗生素的旋链角毛滤液中。这说明经过20 d的放置，旋链角毛藻滤液中的化感物质发生了降解，降解方式包括光降解和细菌降解两种，在本实验结果中，细菌降解强于光降解。

图3 中肋骨条藻在旋链角毛藻不同生长时期滤液中的生长曲线

图4 中肋骨条藻在不同放置方法的旋链角毛藻滤液中的生长曲线

3.4 滤液中化感物质萃取

为了完成化感物质的萃取，首先要研究有机试剂对中肋骨条藻生长的影响。本实验进行了添加体积分数为1%的DMSO、乙醚、乙酸乙酯、正已烷的培养基对中肋骨条藻的培养实验，结果（未列出）显示，除添加1%DMSO的实验组与海水对照组中肋骨条藻藻密度没有显著差异外，乙醚、乙酸乙酯、正已烷对中肋骨条藻的生长都有抑制作用。因此，在后续的提取实验中，经旋转蒸发去除萃取剂，再用0.5%DMSO溶解萃取物，并添加至f／2培养基中用于培养中肋骨条藻，得到的生长曲线如图5所示。从图中可以看出，不同极性的有机萃取物对中肋骨条藻的生长都显示了抑制作用，相同萃取条件下，抑制作用由强到弱的顺序为乙酸乙酯、正已烷、乙醚，三者平均抑制率为75%、48%、16%。此结果说明旋链角毛藻滤液中对中肋骨条藻起作用的化感物质较易溶于乙酸乙酯。

图5 中肋骨条藻在添加不同滤液萃取物的培养基中的生长曲线

3.5 乙酸乙酯萃取物的光谱扫描

已知旋链角毛藻滤液的乙酸乙酯萃取物对中肋骨条藻的生长影响最大，为得到旋链角毛藻化感物质的初步结构，对乙酸乙酯萃取物进行了紫外-可见光区吸光度的全光谱扫描，由结果可知，旋链角毛藻滤液的乙酸乙酯萃取物在255～260 nm处有最大吸收峰，该吸收峰可能为苯环的吸收峰。以人工海水作参比，在258 nm分别测定得到海水、旋链角毛藻指数期滤液的吸光度（表2），结果表明，与海水相比，旋链角毛藻滤液中增加了在此波长范围内有吸收峰的物质，可能是旋链角毛藻的化感物质。

表2 旋链角毛藻指数期滤液的吸光度

4 讨论

化感物质是研究化感作用的关键，也是化感作用这个生态学现象向实际应用领域转化的桥梁，除验证和描述化感现象外，更应关注化感物质的研究。在已知旋链角毛藻对中肋骨条藻具有化感作用的前提下，在鉴定化感物质的确切结构之前，需探究旋链角毛藻化感物质的性质、稳定存在的条件及初步结构，这就是本实验讨论的问题。

为达到富集效果，加热蒸发溶剂是常用的方法，即需要确定化感物质稳定存在的温度范围。本实验结果表明，旋链角毛藻化感物质在50℃以内是稳定的。此外，通常发现化感物质产生的时期是指数期、稳定期和衰亡期，且浮游植物在不同生长时期产生释放的胞外物质成分与含量不同，化感作用效果也就有所差别。例如，稳定期塔玛亚历山大藻滤液对东海原甲藻的抑制作用明显强于指数期［10］。王江涛等［5］发现中肋骨条藻指数期滤液比衰亡期滤液对其本身具有更强的化感抑制作用。本文选取旋链角毛藻不同时期、藻密度相同的滤液培养中肋骨条藻，排除藻密度差异的影响，结果显示旋链角毛藻指数期滤液化感作用强于衰亡期，即旋链角毛藻在指数期分泌更多的化感物质。Mykestad实验表明［11］，指数期主要积累的胞外产物为蛋白质，而多糖主要在N、P限制的稳定期产生。结合以上推测，旋链角毛藻化感物质可能为分解温度在50℃以下的含氮化合物。

溶解有机物的降解途径主要包括光降解和生物降解，二者为竞争关系［12］。其中生物降解主要由细菌造成，而细菌与化感作用的关系，一直以来都存在争论。Uronen等［13］认为，小三毛金藻Prymnesium parvum的化感作用使盐水隐藻Rhodomonas salina分泌的DOC增多，引起细菌量增加，这一过程通过微食物环促进了碳的转换，另外小三毛金藻可能直接吞噬细菌，使其在营养盐限制条件下获得生长优势。但也有实验证明，化感作用效果并不受细菌影响。Tillmann等［14］用抗生素盘尼西林、链霉素处理塔玛亚历山大藻滤液，结果证明，未经抗生素处理的滤液并没有表现出化感作用的减弱。另外，Weissbach等［15］研究发现具有化感作用的塔玛亚历山大藻滤液使细菌生长加快，但对细菌生产力没有影响。本文中分别对滤液进行了暗处放置与除菌处理，与新鲜滤液相对照，以研究旋链角毛藻化感物质的降解特性及细菌在旋链角毛藻化感效应中的作用。已有实验室培养结果表明，0.5 mg／L的链霉素和多粘菌素B联合应用时，对中肋骨条藻生长影响很小，且抑菌效果较理想［16］，本实验中以此方法去除滤液中的细菌，结果海水添加抗生素组与海水空白对照组中培养的中肋骨条藻密度没有差异，也证明这两种抗生素的添加不会对中肋骨条藻的生长产生影响。同时，放置20 d滤液与新鲜滤液培养中肋骨条藻的结果对比显示，新鲜滤液抑制作用强于滤液添加抗生素组强于滤液避光放置组，说明光化学过程和细菌降解过程都会造成旋链角毛藻化感物质的降解，且与光化学过程相比，细菌降解更能减弱化感作用。Obernosterer等认为光化学矿化过程可去除的陆生与水体（含浮游生物）DOC分别为46%与7%，而生物过程能去除27%陆生和74%浮游生物DOC［17］，这与本实验的结果相一致。因此，在旋链角毛藻对中肋骨条藻的化感作用过程中，细菌降解与光化学过程均引起化感作用的减弱，且二者相比，滤液中细菌的存在能够降解更多的化感物质。

为了获得具有明显化感活性的旋链角毛藻代谢产物的粗提物，本实验进行了不同极性的有机物对旋链角毛藻滤液的萃取及各粗提物的化感效应检验。结果显示，相同萃取条件下，具有化感作用的顺序从大到小为乙酸乙酯萃取物、正已烷萃取物、乙醚萃取物。丁慧等［18］指出孔石莼提取物对卵形藻Cocconeis sp.生长影响程度由高到低依次为：乙酸乙酯提取物、乙醇提取物、石油醚提取物、蒸馏水提取物。极性不同的有机溶剂提取的芦竹化感物质对铜绿微囊藻的抑藻作用出现次序由早到晚依次为甲醇提取物、乙酸乙酯提取物、正己烷提取物。此外，乙酸乙酯粗提强壮前沟藻、海洋原甲藻、锥状斯氏藻和长浒苔胞外滤液中的化感物质，都具有抑藻活性［19－20］。本实验发现旋链角毛藻滤液中的化感物质较溶于乙酸乙酯，乙酸乙酯萃取物对中肋骨条藻具有明显的抑制活性，该结果是进一步分离纯化旋链角毛藻化感物质的基础。

紫外光谱是测定有机分子结构的方法之一，通常扫描的是共轭结构的吸收峰［21］。孙颖颖等［22］研究发现球等鞭金藻培养液的乙酸乙酯萃取物具有明显的抑制活性，且抑制物的特征吸收波长为235 nm。本文中旋链角毛藻滤液的乙酸乙酯萃取物在255～260 nm处有最大吸收峰，推测该吸收峰可能为苯环的吸收峰，表明旋链角毛藻化感物质可能为苯衍生物。类似的苯衍生物为化感物质的结果有，金鱼藻和苦草中的邻苯二甲酸酯，邻苯三酚，对羟基苯基丙烯酸和4-羟基-3-甲氧基苯甲酸，均抑制铜绿微囊藻的生长［23－24］。另外，对羟基苯甲酸对小球藻有明显的抑制作用［25］。

5 结论

在已知旋链角毛藻对中肋骨条藻具有化感作用的前提下，本文研究了旋链角毛藻化感作用的影响因素，如温度、生长时期、光照、细菌等，进行了旋链角毛藻滤液化感物质的萃取和化感效应检验，并推测了化感物质的性质和初步结构。结果表明：旋链角毛藻的化感物质在50℃以下保持稳定；旋链角毛藻指数期滤液化感作用强于衰亡期，表明旋链角毛藻指数期产生并释放更多化感物质；光和细菌均引起旋链角毛藻化感物质的降解，且二者相比，细菌能够降解更多的化感物质；旋链角毛藻的乙酸乙酯萃取物具有明显的化感活性，且该萃取物在255～260 nm处有最大吸收峰。综合以上结果，推测旋链角毛藻化感物质可能为分解温度在50℃以上的易被光和细菌降解的含氮苯衍生物，从极性上看较易溶于乙酸乙酯。下一步分离鉴定旋链角毛藻化感物质的实验中，可借鉴这些结论，选择适当的富集方法，对旋链角毛藻化感物质进行纯化，并结合对中肋骨条藻的化感效应检验，应用核磁、质谱等技术对有效的化感物质成分进行鉴定。

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The study on the influencing factors of Chaetoceros curvisetus allelopathic effect on Skeletonema costatum and the primary research on the properties of Chaetoceros curvisetus allelochemical

Zhang Yiwen1，Wang Jiangtao1，Tan Liju1

（1.Key Laboratory of Marine Chemistry Theory and Technology，Ministry of Education，Ocean University of China，Qingdao 266100，China）

On the basis of the fact that Chaetoceros curvisetus showed allelopathic effect on Skeletonema costatum，a series of experiments，including algal cultures and compounds extraction，were carried out to research the properties，influence factors，degradation characteristics and structure of C.curvisetus allelochemical.The results indicated that allelopathic effect of C.curvisetus was related to the growth phase，and the C.curvisetus filtrates in exponential phase caused the inhibition on the growth of S.costatum than that of declining phase filtrates.Chaetoceros curvisetus allelochemical remain stable under 50℃temperature and degraded as time went on attributed on light and bacteria，and bacteria contributed more.Furthermore，the ethyl acetate extraction of C.curvisetus filtrate showed significant allelopathic effect and the wavelength of characteristic absorption for the growth inhibitor was 255－260 nm.Consequently，the effect ingredient was dissolved by ethyl acetate.In addition，the allelochemical of C.curvisetus was supported to be benzene derivatives whose decomposition temperature was more than 50℃and could be degraded by light and bacteria.

allelochemical；Chaetoceros curvisetus；Skeletonema costatum

Q178.53

A

0253-4193（2014）02-0123-07

2012-09-06；

2013-10-08。

国家自然科学基金（41076065）；“973”项目（2010CB428701）。

张议文（1987—），女，山东省威海市人，博士研究生，主要研究方向为海洋生态化学。E-mail：shmilyxiaoxi＠163.com *通信作者：王江涛（1967—），男，河北省承德市人，教授，主要研究方向为海洋生态化学。E-mail：jtwang＠ouc.edu.cn

张议文，王江涛，谭丽菊.旋链角毛藻对中肋骨条藻化感作用的影响因素及化感物质性质初探［J］.海洋学报，2014，36（2）：123—129，

10.3969／j.issn.0253-4193.2014.02.014

Zhang Yiwen，Wang Jiangtao，Tan Liju.The study on the influencing factors of Chaetoceroscurvisetus allelopathic effect on Skeletonema costatum and the primary research on the properties of Chaetoceros curvisetus allelochemical［J］.Acta Oceanologica Sinica（in Chinese），2014，36（2）：123—129，doi：10.3969／j.issn.0253-4193.2014.02.014