抑制IGFBP－2基因的表达对U251细胞增殖和凋亡的影响

许淑芬，王英凯，马寅芙，刘 磊，孙牧男，方艳秋，谭 岩＊

（1.吉林省人民医院中心实验室，吉林长春130021；2.吉林大学第一医院胃肠内科，吉林长春130021）

抑制IGFBP－2基因的表达对U251细胞增殖和凋亡的影响

许淑芬1，王英凯2，马寅芙1，刘 磊1，孙牧男1，方艳秋1，谭 岩1＊

（1.吉林省人民医院中心实验室，吉林长春130021；2.吉林大学第一医院胃肠内科，吉林长春130021）

目的探讨RNA干扰技术沉默胰岛素生长因子结合蛋白2（IGFBP－2）对胶质瘤细胞株U251增殖、凋亡的影响，为胶质瘤的基因治疗提供一个可选择的靶点和方法。方法构建靶向IGFBP－2基因的RNAi表达载体；采用脂质体法将siRNA转染U251细胞，设非特异的siRNA阴性对照组和未转染siRNA的阴性对照组；采用RT－PCR法半定量检测siRNA对IGFBP－2基因表达的抑制作用；用MTT法测定U251细胞增殖变化；流式细胞术检测siRNA诱导细胞凋亡作用。结果构建的RNAi表达载体抑制了IGFBP－2基因的表达（P＜0.01）；RNA干扰沉默IGFBP－2基因可抑制U251细胞增殖，促进细胞凋亡。结论在细胞水平上，构建的靶向IGFBP－2的siRNA可明显抑制IGFBP－2基因的表达，导致胶质瘤细胞凋亡率明显上升（P＜0.01），为进一步利用RNA干扰进行胶质瘤的基因治疗研究奠定基础。

RNA干扰；胶质瘤；胰岛素生长因子结合蛋白2；增殖；凋亡

（Chin J Lab Diagn，2014，18：1572）

胶质瘤是颅内常见恶性肿瘤，占颅内肿瘤的35%－60%。具有恶性度高、易复发、预后差等临床特点。胶质瘤呈浸润性生长，手术无法全切，需结合放疗、化疗、生物治疗等综合治疗手段以延长患者生存期。近年来，国内外随着人们对胶质瘤发生和发展研究的不断深入，基因治疗作为一种新型的肿瘤治疗方法越来越受到人们的重视，且成为胶质瘤研究的热点。胰岛素样生长因子结合蛋白－2（Insulinlike growth factor binding protein－2，IGFBP－2）是胰岛素样生长因子（Insulin－like growth factor， IGF）系统的成员之一，IGFBP－2主要在胎儿增生能力旺盛的组织中表达，出生后表达明显下降。近几年研究显示，IGFBP－2在许多肿瘤中表达明显升高，如胶质瘤［1，2］、前列腺癌［3］、卵巢癌［4］、结肠癌［5］、乳腺癌［6］。并且随肿瘤级别增加IGFBP－2的表达增高，IGFBP－2在肿瘤恶性进展中起重要作用［2］。由此提示IGFBP－2可能作为肿瘤的诊断治疗靶点。本研究依据RNA干扰原理［7］，以IGFBP－2基因为靶点，IGFBP－2高表达的U251胶质瘤细胞为研究对象，构建靶向IGFBP－2基因的RNAi表达载体，用lipofectamin 2000转染U251细胞，研究其特异抑制IGFBP－2基因表达、抑制U251细胞增殖、诱导胶质瘤细胞凋亡的能力。

1 材料与方法

1.1 主要材料胶质瘤U251细胞株、大肠杆菌DH5α、pSilencer2.1－U6neo载体本室保存；Trizol Reagent为Invitrogen公司产品；AMV Reverse transcriptase、Oligo（dT）15primers及RNasin Ribonuclease Inhibitor为Promega公司产品；Taq DNA–polymerase、T4DNA ligase、限制性内切酶BamHⅠ、HindⅢ、DNA Marker均为Takara公司产品；annexin V－FITC／PI凋亡试剂盒购于百奥生物；引物由赛百盛公司合成。

1.2 IGFBP－2siRNA、IGFBP－2、β－actin引物的设计与合成根据GenBank中报道的IGFBP－2的核苷酸序列（NM－000597），参考siRNA及引物的设计原则，利用Ambion公司siRNA在线设计软件。从IGFBP－2核苷酸序列起始密码子下游寻找符合设计特征的靶序列，筛选得到908－926nt 19bp片段为靶序列（siRNA的筛选另报道），设计的siRNA序列5’端和3’端分别引入BamHⅠ、HindⅢ两个酶切位点，加入9bp的loop环结构，3’末端加转录终止信号TTTTTT。同时采用国际通用的与所有基因均无同源性的序列siRNA为阴性对照见表1。经BlastSearch检索确认与IGFBP－2以外的人类已知基因序列无同源性。

基于这些关系表的频繁挖掘方法可以采用直接连接的方法，形成一张大表。但是这种方法会导致性能低下、统计偏斜等问题。故本文利用关系数据库的特点对传统方法进行改进。算法主要包括如下4个步骤。

表1 针对IGFBP－2基因设计的寡核苷酸序列

1.3 重组质粒的构建和转染合成的两条互补siRNA链在退火缓冲液作用下退火，用T4连接酶连接于经双酶切（HindⅢ、BamH I）的质粒pSilencer2.1－U6neo中，连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α，随机挑取菌落。接种于LB培养基中，振荡过夜，质粒提取试剂盒提取质粒鉴定。取对数生长期的U251细胞接种于6孔板，密度达80%时，用lipofectamin 2000转染重组质粒，转染6h以后更换含20%FBS培养液继续培养48h。G418筛选，收集G418抗性细胞。实验分为U251细胞对照组，U251转染空质粒的阴性对照组，转染pSilencer2.1－U6 neo非特异质粒的siRNA对照组，转染pSilencer 2.1－U6neo－IGFBP质粒的目的siRNA实验组。

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1.6 流式细胞仪检测细胞凋亡实验操作按照annexin V－FITC／PI凋亡试剂盒说明书进行，将培养后细胞用PBS洗3次，加入annexin V－FITC／PI 20μl，室温下避光孵育15min，上流式细胞仪进行分析。

2.1 RT－PCR检测IGFBP－2 mRNA表达转染pSilencer 2.1－IGFBP的U251细胞与3个对照组相比IGFBP－2mRNA表达明显降低，差异有统计学意义（P＜0.01）。而3个对照组（无关siRNA对照组、空载体对照组和U251细胞对照组）细胞中都存在较高水平的IGFBP－2mRNA表达，相互比较无统计学差异（P＞0.05）。见表2、图1。

因此，在膨润土MEL计算涉及的“三率”项中，选矿回采率高是普遍容易实现的，因此，选矿回收率权重值控制在30～35为宜，其中采用部分选矿的取30，不选的取35，膨润土资源禀赋可直接加工。

1.4 RT－PCR检测IGFBP－2 mRNA表达使用Trizol试剂盒提取细胞总RNA，参照Invitrogen公司说明操作，使用逆转录试剂盒将mRNA逆转录为cDNA，选择β－actin作为内参照。PCR循环参数为：95℃预变性5min，然后95℃45s、55℃45s、72℃45 s，30个循环后再72℃延伸10min。产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统扫描电泳结果。

2.2 MTT法检测转染siRNA后U251细胞增殖的变化U251细胞增殖水平显示，IGFBP－2RNAi组细胞在24h、48h、72h各时间点A值均明显低于相应时间点的各对照组（P＜0.01），各对照组各时间点A值比较无统计学意义（P＞0.05），结果见表3。

2 结果

1.5 MTT检测细胞增殖变化取各组对数生长期细胞，用胰酶消化收集，调整单细胞悬液密度为2× 106·ml－1个。按每孔200μl（2×103个细胞）接种于96孔培养板内。置37℃5%CO2饱和湿度的培养箱中培养。从第24h开始，每隔24h随机取1块96孔板，每孔加入5g·L－1MTT液20μl，继续培养4 h后，吸出孔内培养液，每孔加入150μl DMSO。将培养板置于微孔板振荡器上振荡10min，使结晶物溶解。酶标仪检测各孔A值，检测波长为490nm，增殖抑制率＝（1－试验组A值／实验组A值）× 100%。

表2 IGFBP－2 mRNA相对表达量（n＝3，x—±s）

图1 RT－PCR检测IGFBP－2 mRNA表达

1.7 统计学处理实验数据采用SPSS 11.5统计学软件进行分析.计量资料以平均值±标准差（x—± s）表示，两两比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2.水进去约数十秒后就会到达全身每个角落，可以促进细胞的新陈代谢，让身体从睡眠中醒过来，有提神醒脑的功效；

表3 RNAi后不同时间各组U251细胞增殖力的变化（n＝3，x—±s）

2.3 转染siRNA后U251细胞凋亡率的变化转染后48h，实验组细胞凋亡率较各对照组明显升高（P＜0.01），各对照之间比较（P＞0.05）差异无统计学意义，见图2。

图2 流式细胞术检测U251细胞凋亡率

3 讨论

胶质瘤是最常见的原发性颅内肿瘤。胶质瘤目前首选手术治疗，术后多采用放疗、化疗等综合治疗，但治愈率仍不理想，平均生存期约50周，因此如何提高胶质瘤的早期诊断率，以及有效地促进胶质瘤细胞凋亡都是人们积极研究的方向；IGFBP－2同属胰岛素样生长因子系统（insulin－like system，ICFs），是一类具有促有丝分裂活性的、参与组织生长和分化的生长因子家族，通过与1型和2型IGF受体（IGFR）相互作用，在不同的组织中刺激细胞增殖和抑制凋亡，从而与一些恶性肿瘤的发生有关［8］。Sallinen等［9］通过cDNA微阵列及组织芯片技术发现，高度恶性的胶质母细胞瘤（GBM）中IGFBP－2高表达，其表达越高，预后越差。Elmlinger等［10］发现，大量表达IGFBP－2的细胞常聚集于肿瘤坏死灶附近，IGFBP－2与GBM形成和进展密切相关。Muller［11］发现，中枢神经系统肿瘤病人脑脊液IGFBP－2显著升高。许多研究发现IGFBP－2血浆水平可预测高级别胶质瘤的临床结局［12，13］。且随着IGFBP－2水平增高预后不良［14，15］。因此提示IGFBP－2可能作为胶质瘤的治疗靶点，通过降低IGFBP－2水平，抑制胶质瘤细胞的生长，促进其凋亡。

本研究设计了能够在细胞内表达靶向IGFBP－2基因的siRNA的质粒并将其导人U251细胞。实验结果表明，RNAi质粒载体的导入明显抑制了IGFBP－2mRNA的表达。空质粒组与空白对照组的结果差异无显著性，排除了质粒本身对基因的抑制作用。阴性对照组与空白对照组的结果差异亦无显著性，说明了RNAi的高度特异性。构建的IGFBP－2RNAi载体转染U251细胞后，MTT和流式细胞仪检测结果显示U251细胞的增殖率明显降低，而凋亡比例显著升高。本实验初步证实了以IGFBP－2为目的基因，通过RNAi技术可特异性地抑制其在人胶质瘤U251细胞中的过度表达，并抑制U251细胞增殖及诱导其细胞凋亡，为未来脑胶质瘤的基因治疗打下了基础。本研究只观察了沉默IGFBP－2基因后U251细胞增殖率降低、凋亡比例升高，其机理及临床可行性等有待进一步研究。

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Effects of RNA interference silencing IGFBP－2 gene on proliferation and apoptosis of human glioma U251 cells

XU Shu－fen，WANG Ying－kai，MA Yin－fu，et al.（Central Laboratory，Jilin Province People’s Hospital，Changchun130021，China）

ObjectiveTo investigate the effect of silencing IGFBP－2with RNA interference on the proliferation and apoptosis of the glioma U251cells，and to provide a viable method for the gene therapy of glioma.MethodsRNAi expression vector for IFGBP－2was constructed and transfected to U251cell with lipofectamin.RT－PCR method was used to detect the variation of IGFBP－2mRNA level.MTT method was used to measure the variation in the proliferation of U251cells.Flow cytometer was used to monitor cell apoptosis and changes.Results The construction of RNAi expression vector inhibited the expression of IGFBP－2mRNA；Silencing IGFBP－2gene with RNA interference could inhibit the proliferation of U251cells and induce the apoptosis of U251cells（P＜0.01）.ConclusionRNAi technique can effectively inhibit the expression of IGFBP－2gene（P＜0.01），hence inhibit the proliferation of U251cells and induce the apoptosis of U251cells.

RNA interference；glioma；IGFBP－2；Proliferation；Apoptosis

R730.264

A

许淑芬（1963－），女，吉林省长春市人，主任技师，主要从事免疫与分子生物学实验技术的研究。

2013－11－26）

1007－4287（2014）10－1572－04

吉林省科技厅项目资助课题，编号（201015220）

＊通讯作者