脂肪酶水解菜籽油脚料工艺条件的优化

杨欣　俆尔尼　胡冰彬

摘要 [目的]优化脂肪酶水解菜籽油脚料的工艺，提高菜籽油脚料水解率。[方法]以菜籽油脚料为原料，选用黑曲霉脂肪酶水解菜籽油脚料，通过单因素试验、BoxBenhnken中心组合设计和响应面法对该脂肪酶水解油脂的工艺条件进行优化分析。[结果]单因素试验得出，黑曲霉脂肪酶水解菜籽油脚料的最适酶添加量为200 U/ml，底物浓度75 mg/ml，酶解pH 7.0，酶解温度40 ℃，酶解时间45 min以及摇床转数150 r/min，此时菜籽油脚料水解率为16.4%。利用BoxBenhnken中心组合设计和响应面法确定了最优工艺条件是：酶添加量245 U/ml，底物浓度为75 mg/ml，酶解pH 7.0，酶解温度是41 ℃，优化后的菜籽油脚料水解率达（26.92±0.86）%。[结论]研究可为菜籽油脚料的进一步开发利用提供参考依据。

关键词 菜籽油脚料；黑曲霉脂肪酶；水解反应；水解率

中图分类号 S509.9 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）05-01526-04

Abstract [Objective] To optimize process conditions of hydrolysis from rapeseed oil sediment by lipase. [Method] With rapeseed oil sediment as raw material， through singlefactor experiment， BoxBenhnken compound design and response surface method， the technique conditions were optimized. [Result] The optimal condition are enzyme concentration 200 U/ml， substrate concentration 75 mg/ml， reaction systems pH 7.0， reaction temperature 40 ℃， reaction time 45 min and table of revolution 150 r/min， the hydrolysis of rapeseed oil sediment is 16.4%. On this base， the four major factors were optimized by using BoxBenhnken central composite orthogonal design and response surface methodology. The optimum conditions were determined as follows factors： enzyme concentration 245 U/ml， substrate concentration 75 mg/ml， pH 7.0， temperature 41 ℃， after optimization of rapeseed oil sediment to hydrolysis rate is （26.92±0.86）%. [Conclusion] The study can provide reference basis for further development and utilization of rapeseed oil sediment.

Key words Rapeseed oil sediment； Aspergillus niger lipase； Hydrolysis reaction； Hydrolysis rate

我国是世界上最大的油菜籽生产国，年产量早已突破1 000万t，在菜籽油加工过程中，油脚料每年排放量高达20万t。油脚料极易发酵变质、酸败发臭，是我国城镇油厂环境污染的重要源头[1]。菜籽油脚料中含有25%～30%的中性油，25%～35%的磷脂[2]，其余为蛋白质、氨基酸、糖等碳水化合物，矿质元素及色素等物质。目前菜籽油脚料主要用来制备生物柴油、饲料、农业肥料等[3]，而从中提取不饱和脂肪酸、甘油、磷脂等，并進一步生产获得附加值高的产品却极为少见，所以油脚料的开发利用成为环境治理和生物资源再利用的重要研究课题。

脂肪酶能催化天然油脂的水解，生成脂肪酸、甘油二酯、甘油一酯和甘油。其中的不饱和脂肪酸是人体必需的营养物质，具有重要的生理功能，不仅能促进身体发育和智力增长，还可调节血脂、提高免疫能力等[4]。菜籽油脚料中天然脂肪酸一般以甘油三酯形式存在，水解甘油三酯的主要方法有：硫酸法，操作过程复杂，脂肪酸质量不稳定[5]；碱皂化法，大量使用无机酸碱，残留物影响产品质量，产生的大量废液对环境造成污染；酶催化水解法，因高效、专一性强，反应条件温和，不污染环境而逐渐成为当今研究的热点之一[6]。

笔者通过黑曲霉脂肪酶对菜籽油脚料的水解作用，对黑曲霉脂肪酶[7-8]添加量、底物浓度、pH、温度、时间以及摇床转数等对水解菜籽油脚料的影响进行单因素优化，利用BoxBenhnken中心组合设计和响应面法对该酶的添加量、底物浓度、pH、温度进行工艺参数的优化分析研究，以达到提高菜籽油脚料水解率的目的。

1 材料与方法

1.1 材料 菜籽油脚料（酸价38.15，皂化值182.64），来自江西南昌。主要试剂：黑曲霉脂肪酶（酶活≥12 000 U/g），Sigma公司；其他试剂均为国产分析纯。主要仪器：

THZC恒温振荡器，江苏太仓市实验设备厂；SK1快速混匀器，常州国华电器有限公司；集热式恒温加热磁力搅拌器，巩义市英峪予华仪器厂；手提式压力蒸汽灭菌器，上海华线医用核子仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 菜籽油脚料的乳化液制备。 因为菜籽油脚料不同于水，所以需要乳化剂来乳化菜籽油脚料形成水包油型（O/W），将底物均匀分散在反应体系中。按照菜籽油脚料∶乳化剂=1.2∶1.0[9]配制菜籽油脚料乳化液，按比例依次加吐温80、司班80和菜籽油脚料于50 ml三角烧瓶中，放入水浴锅75 ℃加热10 min，然后在混匀器上混匀8 min，之后在混匀器上边混匀边加入蒸馏水，混匀8 min后，在水浴锅中加热10 min，这样反复加热混匀数次，至菜籽油与水充分混匀为止。再置121 ℃，30 min水解处理，备用。

1.2.2 脂肪酶水解菜籽油脚料的方法及水解率的测定。

因为脂肪酶水解菜籽油脚料反应为可逆反应，脂肪酶在酯水解和酯化反应中做催化剂用。一般在含百分之几十水的反应体系中进行水解反应，若含水量控制在20%以内则优先进行酯化反应；反应混合物中含水量为70%～90%时，则脂肪酶进行的几乎全为水解反应[10]。

取一定量的菜籽油脚料乳化液于150 ml的锥形瓶中，加入适量的黑曲霉脂肪酶，然后加入柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，置于摇床培养箱中，在一定温度下，经一段时间酶解后，立刻加入50 ml醇醚混合溶液终止反应，用碱滴定法滴定，测得酸价，并做空白对照[11]。

1.2.3.5 酶解时间对酶水解油脂的影响。

取75 mg/ml的菜籽油乳化液3 ml于150 ml的锥形瓶中加入pH为7.0的缓冲液，加入黑曲霉脂肪酶200 U/ml， 40 ℃，100 r/min分别摇床0、30、45、60、120、240、360 min后，取出，加入50 ml醇醚混合溶液，用碱滴定法滴定，比较不同酶解时间对菜籽油脚料水解率的影响。

1.2.3.6 不同摇床转数对酶水解油脂的影响。

取75 mg/ml的菜籽油乳化液3 ml于150 ml的锥形瓶中加入pH为7.0的缓冲液，加入黑曲霉脂肪酶为200 U/ml，40 ℃，分别在转数为80、100、120、150、200 r/min摇床45 min后，取出，加入50 ml醇醚混合溶液，用碱滴定法滴定，比较不同振荡转数对酶促菜籽油脚料水解率的影响。

1.2.4 响应面法优化水解工艺。

根据各单因素试验的结果，采用BoxBehnken设计数学模型[14]，选择对黑曲霉脂肪酶水解菜籽油脚料有显著影响的4个因素，即pH、温度、底物浓度、酶添加量为自变量，以菜籽油脚料水解率为响应值，设计出4因素3水平的试验设计方案，如表1。

3 结论

该试验通过对黑曲霉脂肪酶水解菜籽油脚料的工艺条件进行研究，在单因素试验的基础上，通过Design expert 软件BoxBenhnken试验设计法对黑曲霉脂肪酶水解菜油脚料的酶添加量、底物浓度、pH、温度做了进一步优化研究，确定了最优酶添加量是245 U/ml，底物浓度为75 mg/ml，pH 7.0，酶解温度41 ℃。在此优化条件下，菜籽油脚料水解率为（26.92±0.86）%。

通过碱滴定法滴定酶水解菜油脚料体系中的游离脂肪酸，得出酸价；根据菜籽油脚料本身的酸价和皂化值，通过公式算出酶解菜油的水解率，但因为水解体系中含有缓冲液，且乳化液的颜色会干扰滴定终点的判断，使得该方法重现性不够理想，今后应该对该方法的反应体系进行探索，找出一种方法使得测定方法确定性高，重现性好。

参考文献

[1]XU D G，XIAO L S，CAI Y，et al.Rasearch of lipasecatalyzed synthesis of ethyl hexanoate in nonaqueous conditions[J].Fine Chenicals，2004，21（4）：279-281.

[2] 孙尚德，毕艳兰，徐玲，等.从油脚、皂脚混合物中提取油脂的不同方法的比较研究[J].粮油加工与食品机械，2005（5）：48-49.

[3] ALI KESKINA，METIN GURU，DURAN ALTIPARMAK，et al.Using of cotton oil soapstock biodieseldiesel fuel blends as an alt ernative diesel fuel[J].Renewabl e Energy，2008，554（33）：553- 557.

[4] RAPOPORT S I，RAO J S，IGARASH I M.Brainmetabolism of nutritionally essential polyunsaturated fatty acids depends on both the diet and the liver[J].Prostaglandins，Leukotri enes and Essential FattyAcids，2007，77：251-261.

[5] 王英雄，候相林，王国富，等.不同脂肪酶催化亚麻油水解反应性能的比较[J].中国油脂，2003，28（8）：54.

[6] 李香春，甄宗园.脂肪酶特性及其应用[J].粮食与油脂，2003（3）：19.

[7] 舒正玉，杨江科，闫云君.黑曲霉F044脂肪酶的分离纯化及酶学性质研究[J].生物工程学报，2007，23（1）：96-100.

[8] KOHLER J，WUNSCH B.The allosteric modulation of lipase and its possibebiological relevance[J].Theoretical Biology and Medical Modelling，2007，34（4）：1-16.

[9]李垚.嗜酸乳桿菌转化菜籽油生成共轭亚油酸的工艺研究[D].南昌：南昌大学，2013：18-19.

[10] 柴秋儿.植物乳杆菌洗涤细胞转化生成共轭亚油酸的研究[D].北京：中国农业大学，2005：23-25.

[11] 甘争艳，王静，吾满江，等.微乳液体系中脂肪酶催化油脂水解的反应研究[J].化学与环境工程，2010（6）：110-111.

[12] 陈钧辉，陶力，朱婉华，等.生物化学实验[M].北京：科学出版社，2007.

[13] NAMBOODIRI V M，CHATTOPADHYAYA R.Purification and biochemical characterization of a novel thermostable lipase from Aspergillus niger[J].Lipids，2000，35：495-502.

[14] BEZERRA M A，SANTELLI R E，OLIVEIRA E P，et al.Response surface methodology（RSM） as a tool for optimization in analytical chemistry[J].Talanta，2008，76（5）：965-977.

[15] LIU Y X，JIN Q Z，SHALL L L，et al.The effect of ultrasound on lipasecatalyzed hydrolysis of soy oil in solventfree system[J].Ultrason.Sonochem，2008，18（4）：402-407.

[16] 刘亚轩.超声作用下脂肪酶催化豆油水解反应的研究[D].无锡：江南大学，2009：11-13.