小黑杨玃sneIF5A2/4基因植物表达载体的构建及在烟草中的转化研究

赵思雯　 郑唐春　 臧丽娜等

摘要 [目的]研究杨树eIF5A基因的功能，为林木抗性育种研究提供参考。[方法]构建植物表达载体，利用农杆菌介导法转化烟草叶盘，并对转基因烟草进行分子水平鉴定。[结果]杨树eIF5A基因已经整合入烟草基因组中，且转基因烟草比野生型烟草叶片抗重金属能力提高。[结论]杨树eIF5A基因能促进转基因烟草的抗胁迫能力，为林木抗逆育种机理奠定了理论基础。

关键词 杨树（Populus spp.）；eIF5A；烟草；胁迫

中图分类号 Q786；S718.46 文献标识码

A 文章编号 0517-6611（2014）08-02286-05

Construction of Plant Expression Vector Containing PsneIF5A2/4 Genes of Populus simonii×Populus nigra and Its Genetic Transformation in Tobacco

ZHAO Siwen，QU Guanzheng et al （State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding， Northeast Forestry University， Harbin， Heilongjiang 150040）

Abstract [Objective] To find the gene functions of eIF5A of Populus simonii×Populus nigra and to lay the theoretical foundation for resistant breeding of forest trees. [Method] The eIF5A genes were constructed in plant expression vector and transformed into tobaccos using agrobacteriummediated procedure. Then， the transgenic tobaccos were identified by PCR. [Result] The eIF5A genes were integrated into the genome of tobacco and the transgenic tobaccos all improved viability under heavy metal stress when comparing with the wild type tobacco. [Conclusion] The eIF5A genes have a potentiality to improve viability under a biotic stresses in transgenic plants， and they lay the theoretical foundation of tree breeding for stress tolerance.

Key words Populus spp.； eIF5A； Tobacco； Stress

真核生物的翻譯起始因子5A（Eukaryotic translation initiation factor 5A，eIF5A）是一种高度保守的蛋白质，在真核细胞内普遍存在，是迄今为止发现的惟一一个含有hypusine残基的蛋白质。eIF5A蛋白对hypusine的修饰是其发挥功能、细胞存活和增殖所必须的[1-2]。eIF5A在蛋白质合成起始起作用，通过促进一些特异mRNA 的转移及相关特异基因的表达来促进细胞的增殖、衰老、死亡，或者产生环境胁迫的应答和抵抗能力[3]。例如，Liu等发现拟南芥eIF5A1对木质部形成有促进作用，转基因拟南芥木质部比对照含量高出1倍[4]；而拟南芥eIF5A2是引起细胞程序死亡的信号传导途径的一个关键因素，拟南芥eIF5A2能够调控由有毒力的Pst DC3000侵染所引起的细胞程序死亡[5]。从目前的研究来看，大多数的eIF5A主要克隆于模式植物（如拟南芥）和其他甜土植物（如水稻、玉米和小麦等），而克隆于木本植物的eIF5A基因研究鲜有报道。

杨树（Populus spp.）是一种分布广、适应强、周期短和需求大的重要经济树种，不仅是发展人工林是解决木材短缺的重要途径之一，同时也是木本转基因植物中的模式植物[6]。课题组前期已经对毛果杨中4个eIF5A基因的生物信息学进行了分析，并且利用酿酒酵母初步研究转小黑杨eIF5A基因酵母在不同非生物胁迫下的抗性[7-8]。笔者通过构建植物表达载体，利用农杆菌侵染烟草，获得转基因烟草植株，并进行重金属离子胁迫，以期为进一步开展杨树eIF5A基因在逆境胁迫中的作用和利用基因工程手段提高重要经济林木抗性奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 研究对象。杨树，采自东北林业大学校园多年生小黑杨雄株；野生型烟草（Nicotiana tabacum），由实验室保存。

1.1.2 主要试剂。植物表达载体prok II质粒，由山东师范大学张慧教授惠赠；质粒提取和胶回收试剂盒，购自OMEGA公司；PrimeScriptTM RT reagent Kit、DNA marker、PCR相关试剂、限制性内切酶和T4 DNA ligase，购自TaKaRa公司；pEasyT1载体和EasyPure Plant RNA Kit，购自全式金公司；其他试剂为进口或国产分析纯，市售。

1.1.3 供试菌种。大肠杆菌DH5α感受态，购自天根生化科技有限公司；农杆菌菌株EHA105，实验室保存。

1.2 小黑杨PsneIF5A基因的克隆 用EasyPure Plant RNA Kit试剂盒提取小黑杨幼叶的总RNA，检测纯度和浓度后，以0.5 μg总RNA为起始材料，采用PrimeScriptTM RT reagent Kit试剂盒进行cDNA合成。以单链cDNA为模板，利用表1中克隆基因的引物进行PCR 扩增。

1.3 植物表达载体的构建及转化农杆菌 通过表1中构建载体的引物扩增目的片段，连接pEasyT1载体后，送华大公司测序。测序成功后，分别利用限制性内切酶Xba I、Sac I双酶切pEasyT1PsneIF5A2、pEasyT1PsneIF5A4和prok II质粒，分别回收目的片段后，利用T4DNA连接酶连接后从而得到prok IIPsneIF5A2和prok IIPsneIF5A4植物表达载体，提取质粒送北京华大公司测序。测序成功后，采用液氮冻融法将prok IIPsneIF5A2和prok IIPsneIF5A4质粒分别转化入农杆菌EHA105感受态细胞，挑取单克隆经菌液PCR验证阳性转化子。

1.4 烟草的遗传转化 参考律凤霞和赵勤的烟草转化方法[9-10]：①无菌操作下，将菌液（OD600=0.6）转入离心管中离心5 min（3 000 r/min），弃去上清液，将收集到的菌体用无菌水稀释至终浓度的OD600在0.2～0.3，即可作为侵染用菌液；②无菌操作下，将切成长宽1.0 cm大小的烟草叶片，在侵染液中浸泡2～3 min，轻轻摇晃侵染液，然后用无菌滤纸吸去多余菌液；③将侵染过的叶片在不含抗生素的分化培养基（MS+0.5 mg/L 6BA+0.05 mg/L NAA）上培养，（25±2）℃暗培养条件下共培养2 d；④将共培养的叶片在含有200 mg/L的头孢霉素溶液中清洗3～5 min，用无菌滤纸吸干多余水分后，将叶片放在含有相应抗生素的分化培养基（MS+0.5 mg/L 6BA+0.05 mg/L NAA+50 mg/L卡那霉素+500 mg/L头孢霉素）上培养。第1周每隔2 d脱菌1次，之后每7 d脱菌1次，直至分化出小芽；⑤待抗性芽长成叶片后，将叶片切下在含有抗生素的分生培养基上培养进行2次筛选分化；⑥待2次分化的不定芽长到1.0 cm左右，切下，移入含抗生素的生根培养基上，进行生根培养（MS+0.25 mg/L NAA+50 mg/L卡那霉素+500 mg/L头孢霉素）。

1.5 转基因植株的PCR检测 CTAB法提取筛选后的烟草株系叶片DNA，进行PCR检测，筛选阳性株系。利用表1中prok II通用引物进行PCR扩增。反应程序如下：94 ℃预变性4 min，94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s；72 ℃延伸45 s，共35个循环；再于72 ℃再延伸7 min，PCR结束后取3 μl反应产物，进行1%琼脂糖凝胶电泳分析。

1.6 转基因烟草株系耐重金属Cd2+试验 选取经PCR初步检验的阳性转基因植株，切取长势相同的转基因与野生型烟草叶片，放置在含有300 μmol/L的CdCl2的MS分化培养基上培养，观察烟草叶片对重金属离子的耐受性。每个处理3次重复。

2 结果与分析

2.1 小黑杨PsneIF5A基因的克隆 图1A表明，利用RNA提取试剂盒，从小黑杨组培苗中成功提取总RNA，经检测浓度及质量均可用于下一步试验。图1B表明，以花芽总RNA反转录的cDNA为模板，成功克隆到2条eIF5A基因序列，暫时命名为PsneIF5A2（GenBank No.KC521463）和PsneIF5A4（GenBank No.KC521464）。通过对核酸序列分析发现，这2条同源基因的开放阅读框（ORF）均为483 bp，共预测编码160个氨基酸。通过ExPASY网站（http：//www.expasy.org/tools/pi_tool.html）在线分析，预测2条同源基因编码蛋白的分子量大约为17.5 kDa，等电点pI为5.60。

2.2 植物表达载体的构建及验证 利用限制性内切酶Xba I、Sac I双酶切pEasyT1PsneIF5A2、pEasyT1PsneIF5A4和prok II质粒，分别回收目的片段后，利用T4DNA连接酶连接后转化大肠杆菌，从而得到prok IIPsneIF5A2和 prok IIPsneIF5A4重组质粒（图2 A～B）。分别挑取3个单克隆进行初步的质粒PCR检测，获得700 bp左右目的条带（图2 C）。抽提质粒送公司测序结果显示，小黑杨PsneIF5A基因分别整合到植物表达载体prok II中，未发生碱基突变，至此植物表达载体构建完成。采用液氮冻融法将prok IIPsneIF5A2和 prok IIPsneIF5A4质粒分别转化入农杆菌EHA105感受态细胞，随机挑取6个单克隆经菌液PCR验证，结果显示均为阳性转化子（图2 D）。

2.3 转基因植株的获得及验证 用含有prok IIPsneIF5A的农杆菌EHA105转化烟草叶片后，经4～5周的选择培养，从叶片周围的愈伤组织分化出绿色或淡绿色的抗性芽。将抗性芽分割后培养，继而获得大量从生芽（图3 A）。待丛生芽长出叶片后，将叶片切下在含有抗生素（50 mg/L卡那霉素）的分化培养基上进行2次筛选（图3 B）。将2次分化获得的芽在生根培养基中进行生根定植，获得完整转基因烟草植株（图3 D）。提取生根植株烟草叶片基因组DNA，利用载体prok II的通用引物进行PCR反应。结果表明，在检测的6株抗性烟草植株中，均扩增出了大小为700 bp左右片段，而以野生型烟草为对照的反应，未扩增出条带，因此推测外源基因已经整合入烟草基因组中（图3 C）。

2.4 转基因烟草的耐重金属Cd2+试验 挑选长势相同的转基因及野生型烟草进行Cd2+胁迫试验，同时选取多个转基因株系，每个株系重复3盘以上。当Cd2+胁迫浓度为600 μm/L时，转基因烟草与野生型烟草均在培养1 d后，叶片均失绿、透明化，并死亡（数据未展示）。当Cd2+胁迫浓度为300 μm/L时，在培养后的第3天，野生型烟草叶片出现伤口损伤加重，叶片稍微透明化等现象，而转基因叶片则能正常的吸收水分，叶片膨大（图4 A）；在培养后的第5天，野生型烟草叶片失绿、透明化严重，并死亡，而转基因叶片仅仅表现为稍微变黄，仍能进行分化生长（图4 B）。上述结果表明：转基因烟草比野生型烟草的耐重金属Cd2+能力提高。

3 结论与讨论

研究表明，植物eIF5A基因在植物生长发育中发挥着的重要作用[11-12]。先前已有研究报道，水稻eIF5A基因受盐胁迫诱导高表达[13]，柽柳eIF5A基因在转基因酵母中对盐及渗透胁迫具有抗性[14]。初步说明，eIF5A基因与非生物胁迫有关。前期的研究也表明，杨树eIF5A基因转酵母对盐和渗透胁迫并未表现出明显差异，而是在Cu2+、Cd2+、Zn2+等重金属离子胁迫下差异明显，这说明该基因在植物体内可能参与多种非生物胁迫响应途径[8]。试验将杨树eIF5A转化烟草，证明转eIF5A基因烟草在Cd2+胁迫下，具有明显差异。对其他非生物胁迫的试验正在有序的验证中，但结果和在酵母体内验证存在一定的差异，这可能是因为物种不同造成的。在植物中，已有文献表明eIF5A基因具有多种异构体，各种异构体分别承担不同的生物学功能，共同完成调控生物生长发育、衰老及环境适应等的功能[15-16]。试验克隆出的2条小黑杨eIF5A基因，通过NCBI数据库的序列比对分析表明这2条基因也仅有3个氨基酸上的差异，推测这2条基因在杨树中高度保守，且在功能上存在互补作用。根据这2条基因在转基因烟草中的对重金属离子的耐受性结果也表明，这2条基因在功能让存在冗余，这可能是因为杨树基因组形成时的局部加倍造成的。

为缓解重金属造成的污染，研究人员已开始利用植物基因工程进行植物修复技术的应用，以期提高植物的耐重金属能力。试验通过研究杨树eIF5A基因在烟草中的耐重金属离子胁迫，发现该类基因能提高转基因植株的耐受性，这具有重要的应用价值，为后期的林木优良基因的鉴定奠定理论基础。

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