小黑杨PsnAP1基因转化烟草的研究

李爽　 郑唐春　 臧丽娜等

摘要 [目的]研究杨树APETALA1基因的功能，为缩短林木育种周期及杨树成花机理的研究提供参考。[方法]以杨树为研究对象，构建植物表达载体，利用农杆菌介导法转化烟草叶盘，并对转基因烟草进行分子水平鉴定。[结果]杨树APETALA1基因已经整合入烟草基因组中，且转基因烟草比野生型提早开花。[结论]杨树APETALA1基因能促进转基因植株开花，为研究杨树成花机理奠定了基础。

关键词 杨树；AP1；烟草；早花

中图分类号 S792.11；Q786；S718.46 文献标识码

A 文章编号 0517-6611（2014）08-02278-04

Transformation of Tobaccos with Two AP1 Genes Isolated from Poplar （Populus simonii×Populus nigra）

LI Shuang， QU Guanzheng et al （State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding， Northeast Forestry University， Harbin， Heilongjiang 150040）

Abstract [Objective] To find the gene functions of AP1 of Populus simonii×Populus nigra and to lay the theoretical foundation for molecular regulation of floral meristem in poplar. [Method] The AP1 genes were constructed in plant expression vector and transformed into tobaccos using agrobacteriummediated procedure. Then， the transgenic tobaccos were identified by PCR. [Result] The AP1 genes were integrated into the genome of tobacco and the transgenic tobaccos all presented early flowering phenotype when comparing with the wild type tobacco. [Conclusion] The AP1 genes have a potentiality to promote early flowering in transgenic plants， and they lay the theoretical foundation for molecular regulation of floral meristem in poplar.

Key words Populus simonii×Populus nigra； AP1； Tobacco； Early flowering

高等植物由營养生长向生殖生长转变的调节过程主要是由成花诱导控制的，同时受光周期等环境因素及内源基因的调控。其中APETALA1（AP1）基因在花分生组织诱导和花器官发育过程中起双重作用[1-2]。AP1基因属于MADSbox家族A类基因，在萼片和花瓣的发育过程中起重要作用[3-4]。研究结果表明，大多数转AP1基因植物的开花时间都比野生型提前许多，这说明该基因在植物成花过程中起着非常重要的作用。Pen～a等将拟南芥的AP1基因或LFY基因导入柑橘后，转基因植株不仅能当年开花结实，并且可以通过种子获得次年开花的植株[5]。Kotoda 等将苹果的AP1基因遗传转化拟南芥后，也可促使转基因拟南芥提前开花[6]。Fernando和Zhang将柳树的2个AP1基因转入拟南芥后，不仅能使拟南芥提前开花，并能出现花瓣、雌蕊和雄蕊等畸形的现象[7]。Qu和Huang等将白桦BpAP1基因在烟草和白桦中进行遗传转化，结果表明BpAP1基因在同源和异源转化中，均可促进转基因植株提前开花，缩短植物的生长周期[8-10]。

杨树被作为木本转基因植物中的模式植物，是目前林木树种遗传转化研究中的典型代表种[11]。小黑杨（Populus simonii×Populus nigra）是中国林业科学院于1959年经小叶杨和黑杨杂交而来。多年实践证明，小黑杨是速生丰产的好树种，特别在黑龙江省西部干旱、寒冷地区长势更好，10年即可成为建筑材。目前，关于杨树AP1基因的功能验证研究鲜有报道。笔者以小黑杨为试验材料，从雄花芽cDNA中克隆出来2个AP1同源基因，通过构建植物表达载体，利用农杆菌侵染烟草，获得转基因烟草植株，初步验证了杨树AP1基因能够异源调节转基因烟草开花，以期为进一步开展杨树AP1基因的调节开花时间的功能验证奠定基础，从而为杨树成花机理的研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 研究对象。杨树花芽采自东北林业大学校园多年生的小黑杨雄株；野生型烟草（Nicotiana tabacum），由实验室保存。

1.1.2 供试菌种。大肠杆菌DH5α感受态，购自天根生化科技有限公司；农杆菌菌株EHA105，由实验室保存。

1.1.3 主要试剂。质粒提取和胶回收试剂盒，购自美国OMEGA公司；PCR相关试剂、DNA marker、pMD18T载体、限制性内切酶、T4 DNA ligase和PrimeScriptTM RT reagent Kit，均购自日本TaKaRa公司；EasyPure Plant RNA Kit，购自中国Transgen公司；植物表达载体prok II质粒，由山东师范大学张慧教授惠赠；其他试剂均为进口或国产分析纯，市售。

1.2 方法

1.2.1 小黑杨PsnAP1基因的克隆。用EasyPure Plant RNA Kit试剂盒提取小黑杨雄花芽的总RNA，检测纯度和浓度后，以0.5 μg总RNA为起始材料，采用PrimeScriptTM RT reagent Kit试剂盒进行cDNA合成。以单链cDNA为模板，利用表1中的引物进行PCR扩增。

1.2.2 植物表达载体的构建及转化农杆菌。通过表1引物扩增目的片段，连接pMD18T载体后，送华大公司测序。测序成功后，分别利用限制性内切酶Xba I、Kpn I双酶切pMD18TPsnAP11和prok II质粒，同时也用限制性内切酶Bam H I、Sac I双酶切pMD18TPsnAP12和prok II质粒，分别回收目的片段后，利用T4 DNA连接酶连接后从而得到prok IIPsnAP11和prok IIPsnAP12植物表达载体。提取质粒送北京华大公司测序，验证是否将目的基因插入到植物表达载体prok II中。测序成功后，采用液氮冻融法将prok IIPsnAP1质粒转化入农杆菌EHA105感受态细胞，挑取单克隆经菌液PCR验证阳性转化子。

1.2.3 烟草的遗传转化。参考律凤霞和赵勤的烟草转化方法[12-13]，具体优化如下：①制备侵染液。无菌操作下，将菌液（OD600=0.6）转入离心管中，于3 000 r/min离心5 min，弃上清，将收集到的菌体用无菌水稀释至终浓度为OD600=0.2～0.3，即可作为侵染用菌液。②侵染。无菌操作下，将切成长宽1.0 cm大小的烟草叶片，浸泡到侵染液中2～3 min，期间轻轻摇晃侵染液，然后用无菌滤纸吸去多余菌液。③共培养。将侵染过的叶片在不含抗生素的分化培养基（MS+0.5 mg/L 6BA+0.05 mg/L NAA）上培养，（25±2）℃暗培养条件下共培养2 d。④脱菌。将共培养叶片在含有200 mg/L的头孢霉素溶液中洗3～5 min，无菌滤纸吸干多余水分后，将叶片放在含有相应抗生素的分生培养基（MS+0.5 mg/L 6BA+0.05 mg/L NAA+50 mg/L卡那霉素+500 mg/L头孢霉素）上培养。第1周每隔2 d脱菌1次，之后每7 d脱菌1次，直至分化出小芽。⑤2次分化。待抗性芽长成叶片后，将叶片切下在含有抗生素的分生培养基上培养进行2次筛选分化。⑥生根培养。待2次分化的不定芽长到1.0 cm左右时，将其切下，移入含抗生素的生根培养基上，进行生根培养（MS+0.25 mg/L NAA+50 mg/L卡那霉素+500 mg/L頭孢霉素）。

1.2.4 转基因植株的PCR检测。CTAB法提取筛选后的烟草株系叶片DNA，进行PCR检测，筛选阳性株系。利用表1中构建载体的引物进行PCR扩增。反应程序如下：94 ℃预变性4 min，94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共35个循环；72 ℃再延伸7 min，PCR结束后取3 μl反应产物进行1%琼脂糖凝胶电泳分析。

2 结果与分析

2.1 小黑杨PsnAP1基因的克隆 利用RNA提取试剂盒，从小黑杨雄花芽中成功提取总RNA（图1A），经检测浓度及质量均可用于下一步试验。以花芽总RNA反转录的cDNA为模板，成功克隆到2条AP1基因序列（图1B），暂时命名为PsnAP11（GenBank No.KC866354）和PsnAP12（GenBank No.KC866355）。通过对核酸序列分析发现，这2条同源基因的开放阅读框（ORF）分别为726和750 bp，分别预测编码241和249个氨基酸。预测结果显示PsnAP11基因编码蛋白的分子量大约为28.1 kDa，等电点pI为8.19；PsnAP12基因编码蛋白的分子量大约为28.7 kDa，等电点pI为9.07。

2.2 植物表达载体的构建及验证 图2 A～B表明，利用限制性内切酶Xba I、Kpn I双酶切pMD18TPsnAP11和prok II质粒，同时也用限制性内切酶Bam H I、Sac I双酶切pMD18TPsnAP12和prok II质粒，分别回收目的片段后，利用T4 DNA连接酶连接后从而得到prok IIPsnAP11和 prok IIPsnAP12植物表达载体（图2 C、D、E）。分别挑取2个单克隆进行初步质粒PCR检测，获得750 bp左右目的条带（图3 B），同时分别随机选取其中的2个条带，经过双酶切均获得750 bp左右目的条带（图3 A）。抽提质粒送公司测序结果显示，小黑杨PsnAP1基因分别整合到植物表达载体prok II中，未发生碱基突变，植物表达载体构建完成。采用液氮冻融法将prok IIPsnAP11和 prok IIPsnAP12质粒转化入农杆菌EHA105感受态细胞，随机挑取4个单克隆经菌液PCR验证，结果显示均为阳性转化子（图3 C）。

2.3 转基因植株的获得及检验 用含有prok IIPsnAP1的农杆菌EHA105浸染烟草叶片，经4～5周的选择培养，从叶片周围的愈伤组织分化出绿色或淡绿色的不定芽（图4 A）。将不定芽分割后培养，继而生成大量从生芽。待抗性芽长成叶片后，将叶片切下在含有抗生素（50 mg/L卡那霉素）的分生培养基上培养进行2次筛选分化。将从生芽分离后进行生根定植，获得完整转基因烟草植株（图4 C）。提取生根植株烟草叶片基因组DNA，利用构建载体的引物对获得的抗性植株进行PCR反应。结果表明，在检测的5株抗性烟草植株中，均扩增出了与阳性对照相同AP1基因特异片段，其片段大小为750 bp左右；而以野生型烟草为对照的反应，未扩增出条带，因此推测外源基因已经整合入烟草基因组中（图4 B）。试验结果显示，杨树AP1基因能促进转基因烟草提前进入花期，在组培瓶生根10 d后即能开花（图4 C），将检测为阳性的植株移栽到土里后，早花的转基因植株能快速的开花结实，完成自己的生命周期（图4 D）。

3 結论与讨论

AP1基因自发现起一直广受研究者的关注，拟南芥中AP1基因具有双重功能，即作为拟南芥的花分生组织决定基因，在花原基发育早期阶段起作用，又决定花器官起始和发育，AP1这种双重功能反映在AP1表达模式上[14-15]。杨树PsnAP1基因结构域预测显示，PsnAP11和PsnAP12均包含1个MADS盒和K盒并且位点相同，说明AP1基因在MADS盒区域高度保守；PsnAP11和PsnAP12虽然均有多个蛋白激酶C磷酸化位点和酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点，但两者的功能结构域存在着差异，它们的2级结构也明显不同，可以推测2个AP1同源基因在杨树开花发育过程中的功能可能存在差异，需通过正向和反向遗传学方法来验证其生理功能。根据其不同物种中AP1基因的研究表明，AP1基因主要在生殖器官中表达，所以试验选取材料时，以杨树雄花芽进行目的基因的扩增。杨树PsnAP1基因是否是开花的一个早期信号，成花进程中促进和抑制花芽分化的处理是否对其表达模式有影响，因为受取材时间的限制，尚未对PsnAP1基因在杨树雌雄花器官的不同组织的时空表达模式进一步研究。

植物花分生组织起始和花分生组织特性的维持是由花分生组织决定因子（LFY、AP1、CAL、FUL等）与TFL1的相互作用来完成，其中AP1是花序分生组织向花分生组织转换最重要标志物。研究表明，其与CAL、AGL24、SOC1、SEP3、SVP和AP3等多种MIKC型MADS蛋白发生相互作用[1618]。试验将2条杨树PsnAP1基因与植物表达表达载体重组，遗传转化烟草后，能促使转基因植株提早开花，说明载体构建和遗传转化顺利完成。因此，可以利用获得的转基因烟草进一步分析其早花规律及转基因植株中其他花分生组织决定因子的表达差异，为阐明杨树AP1在林木成花中的作用奠定理论基础。

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