龙头鱼鱼骨多糖的理化性质·结构分析及自由基清除活性研究

金鑫　张申微　牛庆凤　李博　陈荫

摘要[目的]为开发新的软骨多糖资源，对龙头鱼鱼骨进行多糖提取和理化性质分析。[方法] 以龙头鱼鱼骨为材料，对其进行多糖的提取，并分析龙头鱼鱼骨多糖的理化性质、组分结构及其体外清除自由基的活性。[结果]试验表明，龙头鱼鱼骨中含有约3%的多糖。龙头鱼鱼骨多糖主要由葡萄糖组成，还含有少量的半乳糖、甘露糖、葡萄糖胺和阿拉伯糖，比例依次为为8.9∶1.0∶1.0∶1.5∶0.6；还含有5%的硫酸基团。龙头鱼鱼骨多糖为混合多糖，主要含3种组分，分子量分别为780、8和4 kD。通过红外光谱和甲基化分析表明，龙头鱼鱼骨多糖以α构型为主，主要连接方式为（1→4）Glc及（1→2）Glc，多分支结构，分支多发生在（1→4）Glc的6位，还有2位和3位，分支的末端由Glc（1→、Gal（1→和Man（1→组成。此外，龙头鱼多糖具有一定的DPPH和脂质过氧化物的清除活性，半数清除浓度分别为2.35 和2.09 mg/ml。[结论]研究可为龙头鱼资源的充分利用和多糖的进一步开发提供重要依据。

关键词龙头鱼；多糖；结构；自由基

中图分类号S965.399文献标识码A文章编号0517-6611（2014）09-02722-04

基金项目教育部海洋药物重点实验室基金项目（201362049）；浙江海洋学院博士基金项目（21135011413）。

作者简介金鑫（1992-），男，浙江嘉兴人，本科生，专业：药学。*通讯作者，讲师，博士，从事海洋药物研究。

收稿日期20140221 龙头鱼（Harpadon nehereus）属狗母鱼科，龙头鱼属，也称虾潺，为广分布型鱼类，在我国南海、东海和黄海均有分布，是近海张网作业的主要渔获物之一，以浙江舟山、乐清一带产量较高。其富含蛋白质，具有维持钾钠平衡、消除水肿、提高免疫力、调低血压、缓冲贫血等作用[1]。龙头鱼主要用于鲜食和加工鱼粉，如何科学地充分开发利用龙头鱼资源，实现龙头鱼的高值化利用，成了亟待解决的问题[2]。龙头鱼只有一条柔软透明的主骨，状如粗粗的面条，和鲨鱼等软骨鱼鱼骨比较类似。而鲨鱼软骨中富含的鲨鱼软骨多糖，是一种具有抗肿瘤、降血脂、抗血栓和抗凝血等重要生理活性的酸性粘多糖[3]。为开发新的软骨多糖资源，笔者就龙头鱼鱼骨的多糖成分进行系统分析，为其进一步开发利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1材料龙头鱼，购于浙江省舟山市南珍菜场。色谱材料：Shodex OHpak SB804 HQ （8.0×300 mm），日本昭和；Q Eclipse XDB-C18（4.6 μm×250 mm），美国安捷伦科技有限公司。Dextran系列标准品（重均分子量分别为5.9、11.8、22.8、47.3、112.0、212.0、404.0 kD），超级纯，丙烯酰胺；牛血清白蛋白（BSA）、各种单糖和糖醛酸标准品，甲叉双丙烯酰胺，Sigma；其余试剂为分析纯。

1.2方法

1.2.1龙头鱼鱼骨多糖的提取[4]。取龙头鱼清净，蒸熟后取出鱼骨烘干，40 ℃烘干粉碎，90 ℃水浴浸提4 h（料液比1∶20 g/ml）后，60 ℃，pH 2，2%的木瓜蛋白酶，水浴加热3 h，放至室温，调pH至10，加0.5%的胰蛋白酶，水浴加热3 h， 取出水浴加热至100 ℃，灭酶15 min，在4 ℃ 冰箱静置过夜，离心后将上清浓缩至原体积的1/20。用4倍体积的95%乙醇醇沉，将沉淀用无水乙醇和丙酮脱水，透析除盐后冷冻干燥得粗多糖淡黄色粉末（HNP）。

1.2.2 龙头鱼鱼骨多糖的理化性質。以葡萄糖为标准品，采用硫酸-苯酚法测定多糖总糖含量[5]。以牛血清白蛋白为标准采用Folin酚法测定多糖的蛋白含量[6]。采用明胶-比浊法测定各多糖的硫酸根含量[7]。以葡萄糖醛酸为对照，采用硫酸-咔唑法测定多糖的糖醛酸含量[8]。

1.2.3 龙头鱼鱼骨多糖的单糖组成分析[9]。取适量样品，用2 mol/L三氟乙酸在105 ℃加热6 h进行完全酸水解后，采用PMP柱前衍生高效液相色谱法测定单糖组成。

1.2.4 龙头鱼鱼骨多糖的分子量测定[10]。将龙头鱼鱼骨多糖用流动相配成5 mol/L的溶液，采用高效凝胶渗透色谱法（HPGPC）测定。

1.2.5 龙头鱼鱼骨多糖的红外光谱分析（IR）。取干燥的龙头鱼鱼骨多糖1～2 mg与适量的KBr在钠灯的照射下充分研磨至无明显反光，压制成厚度约0.1 mm的薄片，然后采用Nicolet Nexus 470红外光谱仪在400～4 000 cm-1 范围内扫描。

1.2.6 龙头鱼鱼骨多糖的甲基化分析[11]。采用改良的Hakomori法对龙头鱼鱼骨多糖进行甲基化分析。用2 mol/L TFA将甲基化的样品完全酸水解，经硼氢化钠还原，用吡啶和乙酸酐反应生成乙酰化衍生物，进行GC/MS分析。

1.2.7 自由基清除能力的测定[12]。

1.2.7.1 DPPH自由基清除能力的测定。向4.0 ml 0.004% DPPH溶液加入1.0 ml不同浓度的样品，混匀，室温下避光放置30 min，以相应空白溶剂为空白在波长517 nm处测定其吸光度A，计算其清除率，阳性对照为VC。

1.2.7.2 抗脂质过氧化能力的测定。分别加入1.0 ml，不同浓度的龙头鱼骨多糖溶液， 吸取 0.4 ml卵黄的悬液（V卵黄∶VPBS=1∶25）， 再加入0.4 ml 25 mmol/L 的FeSO4·7H2O，用PBS 补充至4.0 ml， 振荡15 min，取出后加入1.0 2 结果与分析

2.1龙头鱼鱼骨多糖的提取及理化性质分析通过热水提取后，两步酶解提取不仅可以去除残存的蛋白，还可以使多糖类物质溶解释放。最终龙头鱼鱼骨多糖的得率为3% 左右，说明龙头鱼鱼骨也存在多糖，但得率不高。对龙头鱼鱼骨多糖进行理化性质分析表明，龙头鱼鱼骨多糖粗品糖含量为87.2%，蛋白含量为4.6%，不含有糖醛酸，含有少量的硫酸基，含量约为5.0%。

2.2龙头鱼鱼骨多糖的单糖组成分析由图1的单糖组成分析结果表明，HNP主要含有葡萄糖（Glc），还含有少量的甘露糖（Man）、葡萄糖胺（GlcN）和半乳糖（Gal），其次还有一定量的阿拉伯糖（Arb），比例依次为8.9∶1.0∶1.0∶1.5∶0.6。从单糖组成上可以确定龙头鱼鱼骨多糖不属于硫酸软骨素类的酸性粘多糖，因为鲨鱼软骨中酸性粘多糖的主要单糖组成是乙酰氨基半乳糖和葡萄糖醛酸，而龙头鱼鱼骨多糖主要含有葡萄糖、半乳糖、甘露糖这些中性糖，含有少量的碱性单糖氨基葡萄糖，唯一相似的是二者均含有少量的硫酸基。海洋动物多糖主要有两类，一类为杂多糖，富含氨基糖、糖醛酸、甘露糖和岩藻糖；另一类则为葡萄糖，龙头鱼鱼骨多糖也主要是以葡萄糖为主，也含有少量的杂多糖。注：A.PMP衍生后10种单糖标准品高效液相色谱图；B.龙头鱼鱼骨多糖PMP衍生后高效液相色谱图；Man.甘露糖；GlcN.氨基葡萄糖；Rha.鼠李糖；GlcA.葡萄糖醛酸；GalA.半乳糖醛酸；Glc.葡萄糖；Gal.半乳糖；Xyl.木糖；Arb.阿拉伯糖；Fuc.岩藻糖。

2.3龙头鱼鱼骨多糖的分子量分布由图2可知，HNP是混合多糖，色谱峰不均一，主要含有3种主要组分。以分子量为5.9、9.6、21.1、47.1、107.0、200.0、344.0和708.0 kD的葡聚糖为标准品，以各自在HPGPC上的保留时间为横坐标，对数值为纵坐标绘制标准曲线，得到计算公式为y=-0.314 4x+9.359 9，R2=0.995 1。把样品所对应保留时间带入，计算得到，HNP分子量分布比较分散，差异较大，主要含有分子量为780.0 kD的高聚糖及2个分子量分别为8和4 kD的低聚糖。多糖分子量的两极分化在很多动物多糖如贻贝多糖中也有体现[13]。

2.4龙头鱼鱼骨多糖的红外光谱分析 HNP的红外光谱如图3所示，是典型的多糖红外光谱。3 402 cm-1处的信号为多糖羟基的伸缩振动吸收峰；在2 930 cm-1附近处的信号为糖环上的次甲基和亚甲基中的C-H伸缩振动的吸收峰；1 021、1 085和1 159 cm-1处的吸收信号为C-O和C-O-C的伸缩振动，三者同时存在表征了吡喃糖环的伸缩振动峰；846 cm-1处的吸收表明糖基中存在α 构型；932 cm-1处的吸收表明葡聚糖为D构型；1 644 cm-1处的吸收为多糖类物质常见的微量水分缔合羟基造成。由此可以初步推测，HNP主要由αD吡喃葡萄糖构成[14]。

2.5龙头鱼鱼骨多糖的GCMS分析为确定多糖的连接方式，对龙头鱼鱼骨多糖进行甲基化后GC-MS分析（图4）。甲基化分析仍然是确定多糖结构的重要方法。甲基化分析结果如表1所示，HNP连接方式较复杂，Man和Gal主要存在于非还原末端，以Man（1→和Gal（1→形式存在。Glc主要存在→4）Glc-（1→和→4，6）Glc-（1→连接方式，和淀粉、糖原等能量物质类似，但还存在少量的→2）Glc-（1→、→3，4）Glc-（1→、→2，4）Glc-（1→及末端葡萄糖Glc（1→。龙头鱼鱼骨多糖遇碘不变色，说明龙头鱼鱼骨多糖并不是糖原类物质。龙头鱼鱼骨多糖中葡萄糖的连接方式与很多海洋动物多糖如紫贻贝多糖及扁玉螺多糖比较接近[15-16]，主要含有→4）Glc-（1→，且具有多分枝结构，分支可能为→4）Glc-（1→的2位、3位和6位。

2.6龙头鱼鱼骨多糖清除自由基能力测定 海洋多糖具有生物活性，如增强免疫调节、降血糖、调血脂、抗病毒、抗肿瘤、抗凝血、抗衰老、抗炎等[17]，在功能性保健食品和创新药物的研究与开发方面具有良好的应用前景。清除自由基活性与抗肿瘤及抗衰老等活性相关。为促进对龙头鱼鱼骨多糖药用价值的深入研究，试验对龙头鱼鱼骨多糖进行初步的清除自由基能力测定。

3 结论

龙头鱼只含有一根主要透明柔软的鱼骨，与软骨鱼类相似，为探索其鱼骨中是否含有硫酸软骨素资源，对龙头鱼鱼骨多糖进行基本研究。通过木瓜蛋白酶和胰蛋白酶两步酶解法对鱼骨进行提取，发现龙头鱼鱼骨中确实存在多糖成分，含量约为3%，对其进行理化性质分析确定其多糖成分不属于硫酸软骨素类成分。龙头鱼骨多糖单糖组成主要为葡萄糖，并含有一定的甘露糖、半乳糖，还含有少量的葡萄糖胺和阿拉伯糖。多糖中不含有糖醛酸成分，含有5%硫酸基。龙头鱼鱼骨多糖和很多动物多糖比较形似，分子量分布两级分化，主要含有一个分子量超过700 kD的高聚多糖和2个分子量分别8和4 kD的低聚多糖。通过红外光谱和甲基化后GC-MS分析对龙头鱼骨多糖进行初步结构分析表明，龙头鱼骨多糖主要以α构型为主，连接方式以→4）Glc-（1→为主，富含分支结构，分支主要存在于→4）Glc-（1→的6位和2、3位，还含有少量的→2）Glc-（1→。多糖分支的末端以葡萄糖、半乳糖和甘露糖组成。对龙头鱼骨多糖进行初步的自由基清除试验表明，龙头鱼骨多糖对DPPH自由基和脂质过氧化物均具有较好的清除能力，且呈剂量依赖关系，其半数清除浓度分别为2.35和2.09 mg/ml。

海洋动物多糖资源主要包括软体动物多糖、海参多糖和鲨鱼软骨多糖，很少对硬骨鱼类鱼骨多糖成分进行研究。该研究对产自舟山海域的龙头鱼骨多糖分析表明，硬骨鱼鱼骨中也存在一定量的多糖，但和软骨鱼富含硫酸软骨素相比有很大差别，其富含葡聚糖，且具有一定的自由基清除能力。该研究不仅拓展了海洋动物多糖的研究范围，开发新的多糖资源，还为龙头鱼骨多糖的进一步分离纯化和生物活性研究提供依据，对龙头鱼的高值化利用具有重要参考意义。

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