应用PCR检测猪伪狂犬病毒野毒的研究

张婕　李增奎

摘要[目的]对猪伪狂犬病毒野毒进行检测。[方法]根据已发表的猪伪狂犬病病毒gE基因核苷酸序列，设计合成1对引物，扩增片段长度为276 bp，优化PCR反应条件，建立检测PRV野毒的PCR方法。[结果]利用建立的PCR方法检测疑似PRV野毒感染的临床送检组织病料34份，阳性样品18份，阳性率达52.94 %（18/34），选取6份阳性病料PCR产物送生工生物工程（上海）股份有限公司进行序列鉴定，测序结果表明均为PRV gE基因特异性序列。[结论]该方法敏感、特异、可靠，可用于PRV野毒感染的快速诊断和流行病学调查。

关键词猪伪狂犬病毒；gE基因；PCR；检测

中图分类号S852.65+1文献标识码A文章编号0517-6611（2014）09-02548-02

作者简介张婕（1982- ），女，土族，青海大通人，助理兽医师，从事畜牧兽医研究。

猪伪狂犬病（pseudorabies，PR）是由猪伪狂犬病毒（pseudorabies virus，PRV）引起的猪的一种急性、热性、败血性传染病[1-2]。PRV属疱疹病毒科（Herpesvifidae）a疱疹病毒亚科（Alphaherpesvirinae），具有疱疹病毒的典型特征，可引起猪的潜伏感染[3-4]。PRV的潜伏感染并不使感染猪表现临床症状，但可使感染猪终身带毒并排毒，增加了PR预防控制的难度，故对PRV潜伏感染猪的筛查至关重要[5]。目前，世界各国广泛应用PRV gE基因缺失疫苗进行PR的防控，且欧美等发达国家应用PRV gE基因缺失弱毒疫苗与其配套的鉴别诊断方法已经实现了PRV的净化[6]。我国自20世纪70年代中期以来，广泛使用gE基因缺失弱毒疫苗，其对PR的防控起到了重要的作用，但同时也给PRV野毒感染和疫苗接种的鉴别诊断带来了较大困难，尤其是2011年以来我国多个使用gE基因缺失弱毒疫苗免疫的规模化猪场出现了PRV野毒的感染与流行[7]，亟待建立可以准确诊断PRV强毒和疫苗毒敏感、特异的鉴别检测方法。鉴于此，笔者根据PRV gE基因序列设计特异性检测引物，经PCR反应条件的优化，建立检测PRV野毒的PCR方法，实现PRV野毒感染的快速鉴别诊断，以期为PR的综合防治提供准确、可靠的依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1研究对象。PRV野毒，由青海省畜牧兽医科学院第一实验室分离鉴定并保存。

1.1.2供试病毒。伪狂犬病病毒活疫苗（Bartha-K61株）和猪传染性胃肠炎病毒（PEDV）猪流行性腹泻病毒（TGEV）二联活疫苗，均购自哈尔滨维科生物技术开发公司；猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）弱毒疫苗（CH-1R株）和猪瘟病毒（CSFV）活疫苗（细胞源），均购自普莱柯生物工程股份有限公司产品；疑似PRV野毒感染猪组织病料，由青海省畜牧兽医科学院第一实验室收集并保存。

1.1.3主要试剂。蛋白酶K、Taq酶和dNTP，均购自TaKaRa公司；SDS、苯酚、氯仿和无水乙醇，均为国产分析纯，市售。

1.2方法

1.2.1引物设计与合成。参照GenBank上的PRV gE基因序列，应用Primer5.0软件设计1对引物，扩增产物大小为276 bp，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物序列如下：F1：5′ GAGATGGGCATCGGCGATTAC 3′；R1：5′ GGGCGAGAAGAGCTGCGAGTG 3′。

1.2.2病毒DNA的提取。采用SDS蛋白酶K法提取PRV病毒基因组DNA，取病毒液500 μl，加SDS溶液至终浓度为1%和蛋白酶K至终浓度为200 μg/ml，56 ℃水浴1 h，加入等體积的酚-氯仿混合溶液，离心，取上清加入2倍体积无水乙醇沉淀病毒DNA，用75%乙醇洗涤后，加灭菌水溶解，-20 ℃保存备用。

1.2.3影响PCR反应的几个重要参数的优化。在保持相同的反应体系和反应条件下，引物F1、R1（20 μmol/L）分别加入0.1、0.5、1.0和1.5 μl；DNA分别加入2、4、6和8 μl；退火温度分别选择58、60、62、64和66 ℃；经PCR反应条件的优化分别确定PCR反应的最佳DNA用量、引物用量、退火温度。

1.2.4特异性试验。用优化确定的PCR反应条件分别检测PRV野毒、PRV疫苗毒的DNA以及PEDV、TGEV、PRRSV、CSFV的cDNA，核酸电泳鉴定PCR反应的特异性。

1.2.5灵敏性试验。将提取的PRV DNA定量，适当稀释，使其含量分别为1.0、0.1、1.0×10-5、1.0×10-6 和1.0×10-7 μg，用优化确定的PCR反应条件分别对其进行检测，核酸电泳鉴定PCR反应的敏感度。

1.2.6重复性试验。分别选取PRV野毒、PRV疫苗毒、3份PRV野毒感染阳性病料、3份阴性病料，重复检测3次，核酸电泳鉴定PCR反应的重复性。

1.2.7初步应用-临床病料的检测。利用建立的PCR方法检测疑似PRV野毒感染的临床送检组织病料34份，核酸电泳鉴定检测方法的临床适用性。

2结果与分析

3讨论

目前，猪伪狂犬病在我国流行广泛，要想逐步控制和消灭该病，在使用弱毒疫苗免疫的同时，还要逐步排查与及时淘汰野毒感染猪，逐步实现PRV的净化。近年来，随着对PRV研究的不断深入，研究学者已建立了多种鉴别PRV强毒感染与弱毒疫苗的方法，如唐勇等[8]、阳爱国等[9]、白静等[10]分别建立了鉴别诊断PRV野毒抗体的gELAT、gEELISA、gEGICA血清学方法，这些针对gE抗体的血清学方法虽然能有效区分野毒感染抗体和疫苗免疫抗体，但病毒感染的早期和潜伏感染期并不产生抗体，故无法做到早发现、早淘汰。田云等[11]建立了鉴别PRV野毒株的荧光定量PCR检测方法，但需荧光定量PCR仪等昂贵仪器，且检测成本较高，操作较复杂，目前只应用于实验室检测。有待于寻找一种更廉价的、操作简单、且能够检测出病毒早期感染和潜伏感染，适合基层应用的临床诊断方法。PCR方法作为简单、常用的分子生物学诊断技术，具有操作简单、特异性强、敏感性高和快速高效等优点。故研究将PCR技术引入到PRV野毒感染的检测中，建立了检测PRV野毒的PCR方法。该方法可有效区分PRV野毒和疫苗毒，检测PRV疫苗毒、PEDV、TGEV、PRRSV和CSFV均为阴性，可以检测到10 pg PRV野毒DNA，具有灵敏、特异、重复性好等优点，可望用于临床上PRV野毒感染的快速检测，以及PRV野毒和疫苗毒的鉴别诊断，对我国PR的净化将起到一定的促进作用。

参考文献

[1] 魏春华，刘建奎，杨小燕，等.猪伪狂犬病病毒的分离鉴定及其gE基因序列分析[J].福建畜牧兽医，2012，34（4）：1-3.

[2] MULLEL T，HAHN E C，TOTTEWITZ F，et al.Pseudorabies virus in wild swine：a global perspective[J].Arch Virol，2011，156（10）：1691-1705.

[3] PASDELOUP D，LABETOULLE M，RIXON J F.Differing effects of herpes simplex virus 1 and pseudorabies virus infections on centrosomal function[J].J Virol，2013，87（12）：7102-7112.

[4] 杨睿，翟少钦，王孝友，等.重庆地区猪伪狂犬野毒株感染的流行病学调查[J].黑龙江畜牧兽医，2013（1）：96-97.

[5] MAHMOUD H Y，SUZUKI K，TSJI T，et al.Pseudorabies virus infection in wild boars in Japan[J].J Vet Med Sci，2011，73（11）：1535-1537.