雅点六齿小蠹的SS—COI技术鉴定

张总泽　陈艳　林阳武　李敏

摘要 [目的] 采用SSCOI技术鉴定雅点六齿小蠹。[方法]采用基于线粒体DNA细胞色素C氧化酶亚基I（mtDNA COI）基因序列的种特异性（speciesspecific COI，SSCOI）PCR方法，设计雅点六齿小蠹SSCOI引物ipsc1和ipsc2。[结果] 该引物特异性强，能扩增出清晰、单一的长度为594bp的特异性条带，与白云杉齿小蠹（Ips perturbatus）、黑条木小蠹（Trypodendron lineatum）、橡胶材小蠹（Xyleborus affini）、欧洲根小蠹（Hylastes ater）、咖啡果小蠹（Hypothenemus hampei）、长林小蠹（Hylurgus ligniperda）进行对照，均无条带出现。[结论]建立的雅点六齿小蠹PCR鉴定方法在实际检疫工作中得到验证和应用，表明该方法特异、灵敏、稳定，可以应用于口岸检疫鉴定工作。

关键词雅点六齿小蠹；SSCOI；PCR；检测

中图分类号S433.5文献标识码A文章编号05176611（2014）09-02588-02

基金项目福建检验检疫局科技计划项目（FK201159，FK201224）；质检公益性行业科研专项（201410076）。

作者简介张总泽（1984- ），男，内蒙古牙克石人，农艺师，从事昆虫检疫鉴定工作。

雅点六齿小蠹Ips concinnus Mannerheim，又名粒点六齿小蠹、西特喀云杉齿小蠹，属于鞘翅目（Coleoptera）、小蠹科（Scolytidae）、齿小蠹属（Ips），分布于美国（阿拉斯加、加利福尼亚、俄勒冈、华盛顿）和加拿大（不列颠哥伦比亚），为害西特喀云杉Picea sitchensis （Bong.） Carrière，是我国进境植物检疫性有害生物。该虫属于初期性害虫，以幼虫和成虫侵害健康树木，取食寄主的有机成分，造成寄主大面积死亡。我国是木材进口大国，近年来，随着国际贸易的不断增长，进口木材和木质包装量也日益增加，特别是一些口岸直接进口未经处理的北美原木，使该虫入侵的风险极大，我国口岸曾多次截获该虫[1-2]。由于该虫在我国尚未分布，所以，加强检疫是防治该虫最为重要的技术措施。

雅点六齿小蠹的鉴定主要基于成虫的形态特征，包括额面特征、前胸背板刻点、鞘翅末端的齿、雄虫生殖器等[3]。而对于口岸检验检疫工作中常截获到的幼虫，则无法用常规的形态学手段鉴定，给快速通关和贸易便利化造成困难。近年来，应用分子生物学方法鉴定有害生物越来越广泛，特别是PCR方法，由于具有快速、微量、灵敏等显著优点，在各口岸检验检疫部门已经普及。笔者采用基于线粒体DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）细胞色素C氧化酶亚基I（cytochrome c oxidase subunit I，COI）基因序列的种特异性PCR（speciesspecific COI，SSCOI）方法[4]，设计了雅点六齿小蠹的特异性引物，对该方法进行了技术验证，为快速准确鉴定该虫提供技术保障。

1材料与方法

1.1供试虫源雅点六齿小蠹（Ips concinnus）、白云杉齿小蠹（Ips perturbatus）、黑条木小蠹（Trypodendron lineatum）、橡胶材小蠹（Xyleborus affinis）、欧洲根小蠹（Hylastes ater）、咖啡果小蠹（Hypothenemus hampei）、长林小蠹（Hylurgus ligniperda）均为福建口岸近年检疫截获的小蠹科昆虫标本，所有试虫均为成虫，经形态学鉴定后用于研究。

1.2DNA提取采用生工磁珠法动物基因组DNA抽提试剂盒（上海生工生物工程有限公司）提取试虫DNA。具体步骤：取单头小蠹成虫，去除鞘翅后置于-20 ℃冷冻10 min，取出后迅速放入1.5 ml离心管中[5]，加入裂解液（400 μl Buffer MACL，200 μl Buffer MCL和20 μl Proteinase K），用塑料研磨棒充分研磨虫体，然后按说明书步骤操作，提取的DNA置于-20 ℃保存备用。

1.3引物设计登录Genebank，查询下载小蠹虫COI基因序列（Genebank登录号见表1）。利用Primer 5和Oligo 6软件，根据引物设计原则[6-7]，设计1对雅点六齿小蠹SSCOI引物：上游引物ipsc1 5′ATGTGGATACACGAGCATACTTTACC3′；下游引物ipsc2 5′GTAATCATTCAATAGAGGC3′。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.4PCR扩增PCR反应体系为25 μl，其中2×Taq PCR Master Mix（天根生化科技有限公司）12.5 μl，上下游引物各1 μl（10 pmol/L），模板DNA 1 μl，ddH2O 9.5 μl。经预试验优化，PCR反应程序：94 ℃预变性5 min；35个循环：94 ℃ 40 s，55.5 ℃ 40 s，72 ℃ 50 s；最后72 ℃延伸10 min。取10 μl PCR扩增产物，在1.5%琼脂糖凝胶上以90 V电泳分离30 min，染色后在凝胶成像仪上观察结果。

1.5特异性及灵敏度试验

1.5.1特异性试验。选取6种小蠹虫成虫，经形态学鉴定后按照“1.2”的方法提取DNA，以雅点六齿小蠹为阳性对照。先用小蠹虫通用引物C1J2183和C1N2611进行PCR扩增[8]，以验证DNA提取质量。然后用SSCOI引物ipsc1和ipsc2进行PCR扩增，以检验该引物的种特异性。

1.5.2灵敏度试验。将提取的雅点六齿小蠹DNA按10-1、10-2、10-3、10-4、10-5倍梯度稀释，用SSCOI引物ipsc1和ipsc2进行PCR扩增，以检验该检测方法的灵敏度。

1.6PCR方法的验证与应用用口岸截获的小蠹科昆虫DNA为模板，以雅点六齿小蠹为阳性对照，用特异性引物ipsc1和ipsc2进行PCR扩增，以检验该方法的准确性和稳定性。

2结果与分析

2.1DNA提取质量检验利用小蠹虫通用引物C1J2183和C1N2611对提取的7种小蠹虫DNA模板进行PCR扩增，电泳结果显示，7种小蠹蟲均能扩增出清晰单一的目的片段，长度约为470 bp（图1）。说明所提取的DNA模板纯度较高，能满足试验需求。

3讨论

准确的物种鉴定是检疫工作的首要任务和基本前提。口岸检验检疫部门对于截获的幼虫，一般情况下要将其在室内饲养至成虫，但受检测周期长、小蠹虫的饲养难度大等限制，不能满足快速通关的要求。近年来，利用分子生物学技术快速鉴定昆虫种类已经成为趋势，在mtDNA COI基因序列分析技术基础上发展起来的SSCOI引物鉴定技术，由于具有重现性好且条带单一等优点，在昆虫快速鉴定中得到广泛应用。