猪瘟母源抗体衰减及保护水平分析

范学政，徐 璐，宁宜宝，王 琴，赵启祖，邹兴启，朱元源，王 芳，丁家波

(中国兽医药品监察所，北京100081)

猪瘟(Classical swine fever，CSF)是猪的一种高度传染病，严重威胁着养猪业的发展。我国的猪瘟兔化弱毒疫苗免疫原性好，效果确实，在控制猪瘟流行起了重要作用，但因缺乏简便有效的免疫监测手段，往往使制定免疫程序缺少依据。母源抗体是母乳中的免疫活性物质，在初免时，如果仔猪体内母源抗体水平较高而施行疫苗免疫，常导致免疫效果不理想。但是，如果母源抗体完全消失后再免疫，虽然免疫效果好，却存在一定的感染风险。母源抗体的半衰期为14 d左右，猪场一般将首免确定在20日龄左右［1］，韩永刚等用残数法推测首免日龄为30 d［2］，另有研究表明，28 ～35 日龄首免可达到较好的保护效果［3］。这些研究对于分析仔猪猪瘟母源抗体变化规律，制定科学免疫程序具有重要实践意义。为了更深入地分析母源抗体与保护效果，本文从母源抗体、中和抗体、攻毒保护等方面进行了研究。

1 材料与方法

1.1 方法

1.1.1 实验动物 实验用猪:10头母猪及所产的10窝仔猪(每窝用5头，共计50头)，免疫对照猪、非免疫对照猪，均来自北京某规模化种猪场。所有仔猪在14 d断奶。日本大耳白兔:购自北京维通利华实验动物技术有限公司，均重1.5～2.5 kg。

1.1.2 试剂与种毒 猪瘟病毒抗体ELISA检测试剂盒:为IDEXX公司产品。CSFV RT－nPCR检测试剂:本实验室制备［4］。HCLV种毒:为本实验室制备，毒价5 ×103RID/0.1mL。

1.2 方法

1.2.1 断奶时母猪抗体测定 在仔猪断奶当天，抽取10头母猪及仔猪血液，分离血清，按1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32 稀释，用猪瘟抗体检测试剂盒检测母猪抗体及仔猪母源抗体水平。

1.2.2 仔猪母源抗体测定 为明确母源抗体在仔猪体内的消长规律，采用5头母猪所产的5窝仔猪(每窝选3～5头，共18头)，在在仔猪断奶当天及以后不同日龄用猪瘟抗体ELISA检测试剂盒测定血清抗体。以阻断率50%分析仔猪抗体水平合格率。

1.2.3 仔猪攻毒实验 分81日龄和35日龄两个组进行，随机挑选1#～5#母猪所产的12头仔猪(每窝2～3头)在81日龄(81日龄组)、6#～10#母猪所产的25头仔猪在35日龄(35日龄组)进行实验。每头仔猪肌肉注射石门毒(剂量为4×103.84TCID50)，同时用6头疫苗免疫猪作对照。攻毒当天采血，分离血清，检测ELISA抗体;攻毒后测定体温变化。81日龄组养至20 d淘汰，对死亡猪和耐过猪均采集全血及颌下淋巴结，用CSFV RT－nPCR检测猪瘟病毒;35日龄组养至27 d，在攻毒后7 d、16 d时采血进行RT－nPCR检测，并在27 d时将所有猪淘汰，攻毒后无论是死亡猪还是耐过猪，均采集全血及颌下淋巴结，用CSFV RT－nPCR检测猪瘟病毒。

1.2.4 中和抗体测定 取35日龄组攻毒当天的部分血清样本，用生理盐水按 1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32倍比稀释，然后与病毒液(100 RID/mL)等量混合，10～15℃作用1.5 h。期间振摇2～3次。同时设不加血清，只加等量生理盐水的对照组。中和完毕，试验组各注射大耳白兔2只，对照组4只，每只耳静脉注射1 mL，缓慢推进。48 h内每天测温两次，48 h后，每6 h测一次，测至120 h。

2 结果

2.1 母猪血清抗体ELISA结果 在仔猪产后14 d断奶时采样检测，结果见图1。

图1 10头母猪抗体水平测定结果

可以看出，在断奶时，除一头毒猪血清抗体(7#)较低外，母猪血清抗体阻断率2倍稀释后都在50%以上，但稀释后检测发现，血清抗体稀释后仍然达到阻断率50%的倍数在不同母猪之间却变化较大，有3头母猪血清抗体可稀释至1∶64，而有2头只能稀释至1∶2，说明该猪场母猪抗体水平很不均衡。

2.2 母猪抗体与仔猪抗体水平关系 图2结果表明:母猪抗体水平高，则仔猪母源抗体水平也相应高，仔猪的母源抗体水平分布也比较一致。

图2 仔猪母源抗体与母猪抗体水平关系

2.3 仔猪母源抗体消长结果 根据5窝仔猪血清抗体平均水平来看，仔猪抗体在断奶后呈缓慢下降趋势，在60 d后，下降较为明显，但有1窝仔猪的抗体水平一直较低(图3a);从群体水平来看，在60 d时仍然有67%(12/18)的个体抗体阻断率在50%以上(图3b)。

图3 仔猪母源抗体水平测定图

2.4 仔猪攻毒结果

2.4.1 81日龄仔猪攻毒结果 攻毒后，所有猪的体温均上升，并伴有食欲不振等临床现象，但有9头猪死亡，3头猪耐过，且体温恢复正常。9头死亡猪只的血清抗体阻断率在8.32% ～60.47%，而3头耐过猪只的血清抗体阻断率在20.71% ～49.01%，与死亡猪无明显区别。不管是死亡猪还是耐过猪，RT－nPCR检测结果全为阳性。

2.4.2 35日龄仔猪攻毒结果 对35日龄仔猪攻毒后，部分猪的体温出现一过性上升，但食欲较好，免疫对照组攻毒后体温正常。25头非免疫猪中有3头猪死亡，但经解剖和PCR检测，这三头猪出现心包炎，腹膜粘连，没有典型的猪瘟症状，也未检测到猪瘟抗原。说明不是猪瘟病毒引起的死亡，疑似猪传染性胸膜肺炎引起的死亡。攻毒后16 d时采血进行RT－nPCR检测，有9头猪呈PCR阳性，在攻毒后27 d时将全部猪放血致死，对血和颌下淋巴结进行PCR检测，尚有2头猪呈PCR阳性(表2)。由此推测，35日龄时母源抗体不能完全抵抗强毒实验感染，尽管猪能存活，但却增加了猪群带毒风险。

表1 81日龄仔猪攻毒结果

2.5 仔猪血清中和效价测定 结果见表3。有3头猪的血清中和效价在1∶4或1∶4以下，有3头猪的为1∶8，有1头猪为116，而免疫对照猪为1∶16。

表2 35日龄仔猪攻毒结果

表3 仔猪血清兔体中和效价分布

3 讨论

C株弱毒疫苗被誉为控制猪瘟的“金标准”疫苗，能诱导针对不同强毒株和各种基因群的免疫保护［5－7］，临床保护率可达 100%［8－9］，免疫猪能抵抗不同模式的强毒攻击［10］，为猪瘟防控发挥了重要作用。但实践中猪瘟免疫失败现象时有发生，除受免疫抑制病的影响外，免疫程序不科学，母源抗体干扰等因素也会影响免疫效果。结合本研究，笔者认为应注意以下问题:

抗体检测的标准方法是中和试验，但是，病毒中和试验操作复杂、影响因素多［11］，不适宜大规模应用。而ELISA因其操作简单和快速而在生产实验中大量应用。据早期文献报道，仔猪中和抗体低于1∶16或等于1∶16为危险线，即猪瘟强毒攻击会出现症状［12］，仔猪抗体1∶32以上，多数猪能抵抗猪瘟强毒攻击［13］。但按1973版《兽医生物药品制造和检验规程》测定兔体中和效价多用固定兔毒20 RID/mL，注射剂量仅为10 RID/只，而现行规程中固定兔毒为至少100 RID/mL，如果按此量推算，按目前规程测定的兔体中和效价，1∶8～1∶16可定为临界线。在本研究中可看出，仔猪母源抗体ELISA测定值与中和效价有一定平行性但并不完全对等，仔猪体内母源兔体中和效价从﹤1∶4到1∶16不等，但1∶8居多，此时攻毒全部猪能存活。但对于母源抗体水平较低的猪，尽管能存活，但带毒时间相对较长。C株疫苗免疫后，可很快诱导细胞免疫，免疫后早期虽然检测不到中和抗体，但猪却能抵抗强毒的攻击，说明免疫早期细胞免疫的作用更加重要。猪瘟疫苗的免疫保护期可达18个月以上［14－15］，如果接种后晚些时间攻毒，猪群中和抗体水平与攻毒保护之间呈现一定相关性［16－17］。目前，许多规模化猪场将猪瘟疫苗初免时间为20日龄，个别猪场提前至15日龄。结合本实验，建议采用30日龄首免。

猪瘟疫苗种类多，抗原含量差距较大，执行统一免疫程序有难度。因此，规模化种猪场制订免疫程序最好以群体抗体检测结果为依据。另外，母猪群的免疫水平及均匀性，直接关系到仔猪群的群体免疫效果。因此，做好种猪群免疫，对于稳定仔猪免疫水平非常重要。值得注意的是，种猪群中有部分母猪抗体水平较低，这些猪很可能发生了先天感染或免疫耐受［13］，对此类种猪要坚决淘汰，避免发生免疫失败现象。

猪瘟综合控制是一个复杂的工程，免疫预防是目前控制猪瘟的重要手段，在使用疫苗的同时，应配合良好的检测手段、以群体抗体水平来评价和优化免疫程序，才能保证猪瘟免疫效果。以净化猪公猪、种母猪和后备母猪为主，淘汰猪瘟病原阳性猪和抗体阴性猪，结合调整猪瘟免疫程序、加强隔离消毒、改善设施、环境治理等综合性措施、协同控制其它疫病的综合控制措施对我国比较适用。

［1］闫学军，邹迎梅.猪瘟母源抗体在仔猪体内持续时间的研究［J］.今日养猪业，2012，06:14－17.

［2］韩永刚，徐庆安，罗晓荣，等.残数法在猪瘟母源抗体代谢动力学研究中的应用［J］.中国动物检疫，2013，36(6):42－44.

［3］余 琼，李 建，周治平，等.猪瘟母源抗体消长规律的测定和免疫效果观察试验［J］.西昌学院学报(自然科学版)，2012，26(1):23－25.

［4］王 琴，王在时，赵 耘，等.12株猪瘟病毒E2基因主要抗原区域的序列差异分析［J］.微生物学报，2000，(06):614－621.

［5］Vandeputte J，Too H L，Ng F K，et al.Adsorption of colostral antibodies against classical swine fever，persistence of maternal antibodies，and effect on response to vaccination in baby pigs［J］.Am J Vet Res，2001，62(11):1805 －1811.

［6］Tu C，Lu Z，Li H，et al.Phylogenetic comparison of classical swine fever virus in China［J］.Virus Res，2001，81(1/2):29－37.

［7］Suradhat S，Damrongwatanapokin S.The influence of maternal immunity on the efficacy of a classical swine fever vaccine against classical swine fever virus，genogroup 2.2，infection［J］.Vet Microbiol，2003，92(1/2):187 －194.

［8］Aynaud J M.Principles of vaccination［M］//Developments in Veterinary Virology·Classical Swine Fever and Related Viral Infections.B Liess.Martinus Nijhoff Publishing，1988(5):165－180.

［9］Dewulf J.Epidemiology and control of classical swine fever:experimental assessment of virus transmission and potential benefits of emergency vaccination［D］.Ph.D.Thesis Universiteit Gent，2002.

［10］王 琴，宁宜宝.猪瘟免疫失败主要原因的解析［J］.中国兽医杂志，2005，(6):61－63.

［11］曾彦钦，吴润生，林志坤，等.酷暑对兔体温和猪瘟定型热比率的影响［J］.福建农业学报，2007，(03):283－287.

［12］施万球，韦家槐，吴建敏.仔猪猪瘟母源抗体调查［J］.中国兽医杂志，1996，(6):10－11.

［13］王 惟，杨 知，付明山，等.猪瘟疫苗免疫低下猪 CD3+CD4+和CD4+CD25+淋巴细胞亚群分析［J］.中国生物制品学杂志，2010，23(4):378－381.

［14］Terpstra C，Woortmeyer R，Barteling S J.Development and properties of a cell culture produced vaccine for hog cholera based on the Chinese strain［J］.Dtsch Tierarztl Wochenschr，1990，97(2):77－79.

［15］Ferrari M.A tissue culture vaccine with lapinized chinese(LC)strain of hog cholera virus(HCV)［J］.Comp Immunol Microbiol Infect Dis，1992，15(3):221 －228.

［16］Aynaud J M，Corthier G，Laude H，et al.Sub－clinical swine fever:a survey of neutralizing antibodies in ther sera of pigs from herds having reproductive failures［J］.Ann Rech Vet，1976，7(1):57－64.

［17］Terpstra C，Wensvoort G.The protective value of vaccine－induced neutralising antibody titres in swine fever［J］.Vet Microbiol，1988，16(2):123 －128.