P13K－Akt信号通路在七氟醚预处理减轻大鼠脑缺血再灌注损伤中的作用1）

杨华丽，韩冲芳，周晓辉，雒 珉，王晓鹏，张建文，张卫卫

脑缺血再灌注损伤可引起脑细胞凋亡。苏氨酸激酶／磷脂酰肌醇－3激酶－丝氨酸（P13K－Akt）是参与细胞增殖分化、抑制细胞凋亡，是细胞生存的一种重要信号通路之一［1］。研究表明，七氟烷预处理对脑缺血再灌注损伤具有保护作用，而这种保护机制尚不完全明确［2，3］。本实验研究P13K－Akt信号通路来评价七氟烷预处理对大鼠脑缺血再灌注损伤中的保护作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 成年雄性SD 大鼠40只，体重220g～280g（山西医科大学动物实验中心提供），按随机数字法，随机分为5组（n＝8）：假手术组（C 组）、缺血再灌注组（IR 组）、七氟烷预处理组（S组）、七氟烷预处理＋抑制剂LY294002（S＋LY组）、溶剂组（DMSO 组）。

1.2 模型制备及分组处理 采用夹闭双侧颈总动脉法制备脑缺血再灌注模型。大鼠称重，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，经口气管插管，接ALC－V8小型动物呼吸机（上海奥尔特生物科技有限公司）行机械通气，潮气量为（5～7）mL／kg，频率为60次／min，吸纯氧，流量为2L／min，吸呼比1∶2。大鼠仰卧固定，颈前正中切开逐层分离，暴露双侧颈总动脉，然后用无创微动脉夹夹闭双侧颈总动脉20 min，松开动脉夹后恢复脑血流灌注，搏动恢复为建模成功。C组只分离双侧颈总动脉；IR 组夹闭双侧颈总动脉缺血20 min，再灌注24h；S组、S＋LY 组、DMSO组在缺血前60min分别经七氟烷挥发罐（Aeommed vp3000）吸入2.4%七氟烷（sevoflurane，H20060586，丸石制药株式会社）、2.4%七氟烷＋侧脑室注入抑制剂LY294002（北京博奥森生物技术有限公司，溶于DMSO 中，0.3 mg／kg）8μL、侧脑室注入DMSO 8μL，缺血20min，再恢复灌注24h。

1.3 标本采集 各组24h灌注结束后取海马组织，置于10%甲醛固定，常规石蜡包埋切片，HE 染色，光镜下（×400）观察各组病理学变化。

1.4 磷酸化Akt（p－Akt）的检测 采用免疫组化法（PV－6001二步法，试剂购于北京中杉金桥生物技术有限公司）检测p－Akt的活性（p－Akt多克隆抗体购于北京博奥森生物技术有限公司）。光镜下p－Akt阳性胞浆呈现黄棕色，每张切片随机选取5个视野，用图像分析系统计算平均光密度值（OD 值），作为评价阳性产物指标。

1.5 细胞凋亡的检测 TUNEL 法检测脑细胞凋亡，检测程序按照TUNEL试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）说明书进行。随机选取5个视野，计算阳性细胞数占总细胞数的百分比（阳性细胞细胞核呈现棕色颗粒），所得指数即为凋亡指数（AI）。

1.6 统计学处理 用统计学SPSS17.0软件分析，实验数据采用均数±标准差表示，组间行单因素方差分析，两两之间采用SNK 法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 大鼠脑细胞凋亡指数 AI及海马组织P－Akt表达 与C组比较，余4组凋亡指数AI及磷酸化Akt 表达均增加（P ＜0.0 5）。同IR组比较，S组凋亡指数AI表达降低明显（P ＜0.05），磷酸化Akt表达增加（P＜0.05），S＋LY 组和DMSO 组各指标变化差异无统计学意义（P＞0.05）。与S 组相比，S＋LY 组与DMSO 组凋亡指数AI表达明显增加，磷酸化Akt表达降低显著（P＜0.05）。详见表1。

表1 大鼠脑细胞凋亡指数AI及海马组织P－Akt表达

表1 大鼠脑细胞凋亡指数AI及海马组织P－Akt表达

与C组比较，1）P＜0.05；与IR 组比较，2）P＜0.05；与S组比较，3）P＜0.05。

组别 AI P－Akt C组 1.547±0.792 0.141±0.020 IR 组 38.595±4.0041） 0.268±0.0511）S组 26.793±4.4411）2） 0.347±0.0521）2）S＋LY 组 39.973±6.8101）3） 0.270±0.0591）3）DMSO 组 38.461±2.7031）3） 0.280±0.0331）3）

2.2 各组海马组织光镜观察 C组神经元细胞分布均匀，形态正常，核圆形或椭圆形，核仁清楚可见。IR 组、S＋LY 组及DMSO 组脑细胞排列分布稀疏紊乱，数目减少，胞核固缩或溶解，边界模糊不清，核仁模糊，凋亡细胞增多。S组脑神经元细胞排列稍不整齐，大部分细胞结构尚清晰，细胞损伤轻微。

3 讨 论

有研究显示，选择2.4%的七氟烷浓度进行研究，以夹闭双侧颈动脉法制备大鼠脑缺血再灌注模型［4，5］。本实验结果显示，与S组比较，IR 组AI值升高显著，p－Akt降低显著，海马组织病理学损伤明显，提示脑缺血再灌注损伤模型制备成功。

大鼠脑海马区神经元对脑缺血反应较敏感，表现为细胞的凋亡、坏死，最终导致神经元数目减少，进而影响生物学功能［6］，因此选其作为研究对象。本实验中，以凋亡指数AI来评价海马组织神经元细胞损伤情况，IR 组细胞损伤严重，AI显著增高，S组AI降低明显，细胞坏死损伤轻微，说明七氟烷预处理能有效减少细胞凋亡，对脑缺血再灌注损伤起到一定的保护作用。

PI3K 是一种联系胞外信号与细胞应答的桥梁分子，在上游或旁路信号分子的影响下，通过活化下游的多种效应分子，并作用于下游分子而调节细胞周期运行以及抑制细胞的凋亡［7］，而Akt是PI3K 下游重要的效应介质之一，是该通路的中心枢纽和直接靶点，直接传递着PI3K 的信息［8］，Akt磷酸化激活后，增加NOS生成、抑制下游凋亡蛋白Caspase－9 等的表达，促进抗凋亡 蛋 白Bcl－2等 的 表 达 而 发 挥 抗 凋 亡 作 用［9，10］，因 此，PI3K－Akt信号通路对细胞的增殖和存活起着重要的作用［11］。研究表明，心肌缺血再灌注时，活化的Akt可以防止细胞凋亡，促进细胞的存活，减轻缺血再灌注损伤［12］。本研究结果显示，与IR 组比较，S组P－Akt表达增加，使用PI3K 特异性抑制剂LY294002后，P－Akt表达下调，七氟烷保护效应消失，提示PI3K－Akt信号通路介导了七氟烷预处理减轻脑缺血再灌注损伤中的作用。七氟烷预处理可通过激活PI3K／Akt信号通道而发挥减轻大鼠脑缺血再灌注损伤。

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