陆生动物诊断实验和疫苗手册（2013版）：蜜蜂盾螨病

徐国群郑火青译

（1浙江衢州出入境检验检疫局，衢州324002；2浙江大学动物科学学院，杭州310016）

陆生动物诊断实验和疫苗手册（2013版）：蜜蜂盾螨病

徐国群1郑火青2译

（1浙江衢州出入境检验检疫局，衢州324002；2浙江大学动物科学学院，杭州310016）

蜜蜂盾螨病(Acarapisosis or acariosis or acarine disease)是西方蜜蜂和其他蜜蜂种成年蜂的一种疾病，由跗线螨（Tarsonemid mite），也被称为气管螨（tracheal mite），武氏蜂盾螨(Rennie亚种)（Acarapis woodi）引起。螨虫体长约150 μm，是蜜蜂呼吸系统的一种体内寄生虫，主要在蜜蜂的前胸气管内生活、繁殖。有时也寄生在头、胸和腹部气囊。螨虫以寄主的血淋巴为食。

对被感染蜜蜂的致病作用取决于气管内的寄生螨虫数量，引起机械损伤和生理紊乱，并导致气道阻塞，气管壁病变和血淋巴衰竭。随着寄生螨虫数量增长，由于黑色素的缘故，气管壁由正常的白色半透明变成不透明并带有黑色疤痕。

死亡率中等到高。感染的早期表现通常被忽视，只有当感染较严重时临床症状逐渐明显。发病通常在早春，通过直接接触感染。一般来说，只有新出房10天内的蜜蜂容易感染。在成年蜂气管内繁殖，雌螨一次产8～20粒卵。雌螨数量是雄螨的2～4倍。雄螨发育期为11～12天，雌螨14～15天。

病原鉴定：寄生螨虫须通过实验室方法和显微镜检诊断。观察蜜蜂气管内的螨虫或者将它们移至显微镜下观察。有几种用于诊断螨虫的技术，如解剖法、研磨法和染色法。

解剖疑似感染蜜蜂的胸部，暴露气管。在18～20倍解剖显微镜下检查每根气管，通过透明气管壁可见小的椭圆形螨虫体。或将疑似感染蜜蜂的大量样品进行研磨或在水中混匀，随后粗过滤和离心悬浮液。沉淀物用未稀释的乳酸处理10分钟，然后再用显微镜检查。

利用组织学技术染色，在蜜蜂气管内可观察到寄生螨虫。分离气管，用浓度8%的氢氧化钾溶液清洗，再用浓度1%的亚甲基蓝溶液染色。这是处理大量样品的最佳方法。

血清学试验：血清学试验不可用。

疫苗和诊断生物制品要求：没有可用的生物制品。薄荷醇晶体或者用植物油（不是动物脂肪）和颗粒白糖制成饼能将螨虫数量控制在可控范围内。

图1 武氏蜂盾螨（Rennie亚种）。上：成年雄性，中：成年雌性，下：卵

一、介绍

蜜蜂盾螨病（Acarapisosis）是西方蜜蜂和其他蜜蜂种（Apis species）成年蜂的一种疾病，由细跗线螨科的武氏蜂盾螨（Rennie亚种）引起。螨虫体长约150 μm，是蜜蜂呼吸系统的一种体内寄生虫（图1）。这些气管螨侵入蜜蜂的大前胸气管，并生长、繁殖，以寄主的血淋巴为食（图2）。有时也寄生在头、胸和腹部气囊。

对蜜蜂个体的致病作用取决于气管内寄生螨虫的数量，同时造成机械损伤和生理紊乱，并导致气道阻塞，气管壁病变和血淋巴衰竭。随着寄生螨虫数量的增长，由于黑色素的缘故，气管壁由正常的白色半透明变成不透明并带有黑色疤痕。

死亡率中等到高。感染早期症状只是蜂群规模缓慢衰落，通常被忽视。只有当感染较严重时才逐渐明显。发病通常在早春，经过冬季的结团之后，螨虫进行繁殖，加上没有干扰进入越冬蜂群。这主要适用于北半球，蜜蜂繁殖有季节性变化的地区。

蜜蜂之间直接接触造成传染扩散。一般只有10天内新蜂易感染。尝试用人造及合成饲料饲养武氏蜂盾螨未能成功，而在蜜蜂的不成熟阶段培养它们也只是部分成功。死蜂体内中螨存活约1周。在成年蜂气管内繁殖，雌螨一次产8～20粒卵。雌螨数量比雄螨多2～4倍。雄螨发育期为11～12天，雌螨14～15天。

诊断蜜蜂盾螨病缺乏典型的临床表现，其感染症状不特定，蜜蜂的表现与感染其他疾病或病症的蜜蜂大致相同。它们在蜂箱的前面爬行，在草的叶片上攀爬，不能飞行。可能同时患痢疾。

二、诊断技术

1.病原鉴定

在实验室里仅需用显微镜检查或者酶联免疫吸附方法（ELISA）就可检出蜜蜂盾螨病。目前，还没有检出感染水平非常低的可靠方法。蜜蜂样品的数量决定了该方法的检测阈值。采用顺序采样，抽取50只蜜蜂样品可检测约1～2%的感染率，已经证明，数据是有效的。采取蜜蜂样本的最佳时间是在早春或晚秋（北半球），此时蜂盾螨的群体高。老龄蜂有更多的螨虫，更容易肉眼观察到。蜂王、雄蜂或者工蜂都可以作为样品，但蜂盾螨偏爱雄蜂。

a）解剖法

从可疑蜂群随机抽取50只蜜蜂样品，主要来自蜂箱前3米范围内爬行和不能飞行的蜜蜂。这是从蜂群中随机取样最好的方法。蜜蜂可能是活的、濒死或死亡的。活蜂先用酒精或冷冻（-20℃）致死；死亡蜜蜂可在4℃保存4周，或-20℃保存几个月，否则不能超过2～3天。可在防腐剂中长期保留，如Oudemann溶液：冰醋酸（80 ml）；甘油（50 ml）；70%酒精（870 ml）。

（1）直接制备法，试验步骤：

i）从蜜蜂的胸部去掉腹部（见图3）。

ii)由头部顶端拿起胸部，在双目放大镜下放大20～30倍检查。

iii)用一对镊子，去除第一胸节的侧胸骨片和第一对足。环形开口可见胸部气管的主干和头部的分支气管。

iv)用一对细镊子，去除第一胸节胸背甲和第二胸节部分胸背甲。清除覆盖的肌肉，暴露两根胸气管。若1根或2根气管有黑变，或在气管内易见椭圆形的半透明体（卵等）存在（轻微感染时），可诊断为阳性。。

图3 准备工作，用于呈现蜜蜂第一胸节气管内的武氏蜂盾螨

v）如需进一步显微镜检查（如确认轻微感染），取下气管，并把它们放到一个载玻片上，加1滴水。在100倍放大倍率的显微镜下，可以辨别成年螨虫以及其生长的各个阶段，。

（2）浸离法，试验步骤：

i）背朝下仰卧固定，或用拇指和食指捏住。

ii)用小镊子去掉头和前足，去除颈四周的颈片，暴露气管（图4）。检查离气门最近的气管（因螨虫通过气门进入气管）看是否有轻微感染。严重感染容易在清晰的深褐色气管看见阴影或深色疤痕。老旧的严重感染将导致气管棕色至黑色。

iii)在中间两肢前和前翅基部位置分别用锋利刀片切断胸部，所得的薄圆片经进一步处理，清除肌肉组织。

iv)浸软，置8%氢氧化钾溶液微加热约20分钟，或不加热静置过夜。

v)用18～20倍放大倍率的解剖显微镜检查有肌肉组织覆盖的第一对气管，或将气管移到另一载玻片上，加甘油或水，以更高的放大倍率观察。

vi)通过透明的气管壁可容易看到小的卵圆形螨虫体。

图4 左：前视图，去除头部的蜜蜂胸腔，颈片完好。右：去除颈片，气门开口处暴露气管

这是实验室诊断蜜蜂盾螨病最简单、最可靠的技术，能检测早期感染，确定感染率。即使是轻微的感染，也可以利用这项技术，使用解剖显微镜进行检测。只有在非常特殊的情况下，才有必要在诊断时采用更高的放大倍率。然而，这项技术要求较高，特别是需要诊断大量蜜蜂盾螨病。如果只需要区别严重感染、轻微感染或未感染的蜂群，只需要解剖至第二步，观察气管的颜色即可。

b)研磨法

随机从疑似感染蜂群中抽取200只蜜蜂样品。从胸部去除每只蜜蜂的翅和足，将剩余身体部分浸入盛有四分之一水的100 ml容器中。加入更多水，将悬浮液以10000 rpm在匀浆器上匀浆3次，每次几秒钟。将所得悬浮液用筛（目数0.8mm）过滤，并且用水冲洗筛，得到最终体积近50 ml的液体。将滤液1500转离心5分钟，弃上清液。沉淀物可能含有螨虫，加几滴未经稀释过的乳酸溶液。静置10分钟，使肌肉纤维溶解。然后装在一个盖玻片镜检。

这项技术比解剖法更快，但不够精确。体外寄生螨外蜂盾螨、游离蜂盾螨和背蜂盾螨,在外观上与武氏蜂盾螨相似，在健康蜜蜂的胸部常常可以发现，很容易被误认为是武氏蜂盾螨（表1）。然而他们并不对蜜蜂或养蜂业造成严重威胁。因此，这种方法只能用于粗略估计一个地区感染程度，不适合用于第一次暴发时确诊。

表1 Acarapis种的鉴别诊断

c）染色法

对螨虫和气管进行特别染色，显微镜下易见。

测试步骤：

i）去掉头和前足。

ii）在前足后面的膜状区域横切一刀。

iii）在前翅的基部，中间一对腿前面，再横切一刀。

iv）切片（1～1.5mm厚）清理干净后，置8%氢氧化钾溶液。

v）轻轻搅拌，加热至接近沸点约10分钟，直至软的内部组织溶解、清除，保持几丁质组织完好。

vi）用自来水过滤，清洗，取回切片。

vii）染色，封固切片。

viii）在低倍显微镜下检查螨虫。

通常的组织学技术可以制备永久封固切片。

阳离子染料是最合适和特效的，因为他们对螨虫染色强，而对气管染色弱。最合适的是1%的亚甲基蓝水溶液，可以先将亚甲基蓝溶解，再加入氯化钠，制成0.85%氯化钠溶液。

试验步骤：

i）用1%亚甲基蓝水溶液染色。

ii）切片在蒸馏水中分化2～5分钟。

iii）切片用70%酒精冲洗。

当用95%酒精保存时，螨可再着色6小时。这种技术的关键是在氢氧化钾溶液中有效浸软组织。使用这种方法可以迅速和方便地处理大量样品。

d）酶联免疫吸附方法

已经研制出诊断气管螨的ELISA方法。这种方法可能会产生假阳性结果，因此只建议用于普查。另一种方法是观察鸟粪素——螨虫的含氮代谢废物。

三、所需疫苗和诊断生物制品

没有可用的生物制品。薄荷醇晶体（50 g可用于一个双层的蜂群）防治螨类只要在蜂群里放置28天，要求环境温度至少18℃。气化的最适温度范围为27～29℃。用氢化植物油（如人造奶油，不含动物脂肪）和白糖制成的小糖饼将螨发病率控制低至10%。糖饼（约100 g重）应在秋季和早春放置在巢箱框梁顶部。甲酸可用于治疗受侵染的蜂群。

蜜蜂的一些品种（系），如布克法斯特蜜蜂（Buckfast bees）和善于清洁的品系，较少受到蜂盾螨的侵染。