siRNA沉默MAG促进脑出血后大鼠运动功能的改善*

刘安民，罗铭，蔡望青，陈舒，何明亮，潘伟生

(中山大学孙逸仙纪念医院1神经外科，2肿瘤科，广东广州 510120;3香港中文大学，中国香港)

siRNA沉默MAG促进脑出血后大鼠运动功能的改善*

刘安民1△，罗铭2，蔡望青1，陈舒1，何明亮1，潘伟生3

(中山大学孙逸仙纪念医院1神经外科，2肿瘤科，广东广州 510120;3香港中文大学，中国香港)

目的:研究慢病毒介导的siRNA沉默髓鞘相关糖蛋白(MAG)对脑出血后脱髓鞘再生和神经功能恢复的影响。方法：SD大鼠45只，随机分为3组:模型+siRNA组、模型+PBS组和正常对照组，每组15只。胶原酶诱导建立脑出血模型，据不同组别于模型术后1 d立体定向下进行侧脑室注射携带MAG基因siRNA的慢病毒和PBS。分别于治疗前1 d和治疗后1、7、14、21 d用Rotarod运功功能评分检测大鼠神经功能情况，应用劳克坚牢蓝(luxol fast blue)检测脑损伤区的神经纤维恢复情况，利用免疫组化和Western blotting检测MAG的表达变化。结果:Rotarod评分检测脑出血模型大鼠术后的运动功能，模型+siRNA组的神经功能改善和神经纤维修复较模型+ PBS组明显提高(P＜0.05)，劳克坚牢蓝染色示siRNA组较PBS组的神经纤维损害范围缩小，siRNA组的MAG蛋白的表达较PBS组明显下降(P＜0.05)。结论:siRNA沉默MAG后明显提高神经纤维髓鞘再生能力，促进脑出血后神经功能缺失的修复。

髓鞘相关糖蛋白;RNA干扰;髓鞘再生;脑出血;大鼠

自发性脑出血(intracerebral hemorrhage，ICH)是一种临床常见病，其发病率、死亡率很高，即使生存者也往往留下明显的神经功能障碍，但至今对其病理损伤机制尚不完全明确［1］。我们的前期研究发现，髓鞘相关糖蛋白(myelin-associated glycoprotein，MAG)是维持中枢神经系统神经纤维髓鞘结构和功能稳定的重要结构，ICH后MAG蛋白的表达显著升高，MAG是抑制ICH后髓鞘再生的重要原因之一［2-3］。许多研究证实，髓鞘的相关抑制因子(如MAG等)是神经再生的关键性抑制因素［4-5］。在近期的研究中，我们采用RNA干扰技术，构建重组慢病毒载体，筛选鉴定出的shRNA能高效、特异性沉默MAG的表达［6］。本研究将把已经鉴定的、稳定表达MAG siRNA的慢病毒载体利用脑定向注入ICH模型的侧脑室内，探讨沉默MAG对ICH后脑损伤髓鞘再生的作用。

材料和方法

1 主要材料

SD大鼠(中山大学实验动物中心提供)，胶原酶Ⅳ型(Sigma)，鼠抗人MAG单克隆抗体和鼠抗actin多克隆抗体为Santa Cruz产品。立体定位仪为David Kopf Instruments产品，微型颅钻为NSK Volvere GX产品，上海安亭微量进样器厂微量进样器，Rotarod motor test测试仪由中山大学药学院提供，Bio-Rad电泳仪，OKAMOTO X3自动X线显影仪，Bio-Rad Model GS-670灰度分析扫描仪，Canon照相机和Zeiss显微镜成像系统。

2 动物和分组

健康雄性SD大鼠45只，体重220～230 g，鼠龄10周。实验随机分为模型+siRNA组、模型+PBS组和正常对照组，每组15只。

3 模型制作

内囊脑出血动物模型定位［7］:腹腔注射麻醉后，俯卧位将大鼠头部固定在立体定位仪上，保持前囟和后囟在同一水平。于颅正中线上切开皮肤约1.5 cm，据定位用颅钻钻一直径约1 mm的骨孔，通过立体定位仪定位，利用微量进样器将0.21 CDU/1.5 μL胶原酶Ⅳ型缓慢推进脑内，注射时间维持5 min，注射完后将针停留5 min后缓慢退针，再用骨蜡封闭骨孔、缝合头皮。

4 重组慢病毒MAG基因siRNA的制备

我们成功完成了运用慢病毒载体系统进行重组慢病毒MAG siRNA的制备，并证实慢病毒介导的shRNA干扰技术可特异性沉默MAG的表达，见参考文献［6］。

5 侧脑室注射方法

大鼠左侧脑室模型定位［2-3］，颅骨背侧中线左旁1.3 cm，前囟前0.8 cm，深度为脑表面下3.7 cm。操作步骤:操作步骤基本同模型制作，通过立体定位仪定位，利用微量进样器据不同组别将6 μL慢病毒MAG基因siRNA(1×1011cfu/L)和6 μL PBS缓慢推进ICH模型大鼠的左侧脑室内，注射时间维持5 min，注射完后将针停留5 min后缓慢退针。

6 大鼠行为学检测

大鼠行为学检测:运用Rotarod运动功能测试评分［2，7］。前3 d开始进行Rotarod功能训练，大鼠放在加速、旋转的圆柱体上(5 min内4～40 r/min)，记录大鼠在Rotarod上停留的时间。以大鼠从柱上掉下、抱住圆柱、旋转2圈或以上为测试结束。分别记录术前1 d和治疗后1、7、14、21 d大鼠在Rotarod柱上的持续时间。每个时点测试3次，取最长的持续时间(以秒计算)为每次测试时间。将术后测试时间与术前最长测定时间相比的百分率作为比较参数。

7 标本处理、组织学染色和蛋白定量分析

于术后第21 d行为学实验后处死大鼠，脑组织按常规处理，石蜡包埋固定，做层厚5 μm切片，进行劳克坚牢蓝(Luxol fast blue)染色观察神经纤维情况和免疫组化染色观察MAG。常规取脑组织，Western bloting测定MAG蛋白含量。

8 统计学处理

数据以均数±标准差(mean±SD)表示，运用SPSS 13.0统计软件，均数比较采用t检验或单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1 实验动物数量分析

所有动物术后均存活，无一伤口感染、死亡等。术后脑出血模型大鼠均出现肢体偏瘫症状，再次手术进行治疗后大鼠均存活，无一死亡例数。所有45只大鼠均进入结果分析。

2 siRNA干预对ICH大鼠运动功能的影响

模型+PBS组和模型+siRNA组大鼠治疗后1、7 d的Rotarod评分无显著差异(P＞0.05)。治疗后14 d，模型+siRNA组的Rotarod持续时间较模型+ PBS组明显延长(P＜0.05)，此种差异一直延续到治疗后21 d，见图1。

Figure 1.Results of Rotarod motor test.Model+siRNA group showed better performance from 14 d and these benefits continuned up to the 21st day.Mean±SD.n= 6.*P＜0.05 vs model+PBS group.图1 大鼠Rotarod运动功能评分比较

3 siRNA治疗对有髓神经纤维的修复

术后21 d的脑组织切片劳克坚牢蓝染色结果显示，有髓纤维呈鲜蓝色，神经细胞胞体及尼氏体呈微紫色。正常组脑内有髓纤维正常分布，模型+PBS组血肿周围组织仅有少量蓝染的有髓神经纤维，模型+siRNA组可见较多的蓝染有髓神经纤维;在血肿周围组织，模型+siRNA组较模型+PBS组的神经纤维损害范围缩小，见图2。

Figure 2.Representative images of Luxol fast blue staining of myelin in coronal sections of the ipsilateral internal capsule with intracerebral hemorrhage(ICH)on the 21st day(×50).A:normal rat;B:remarkable demyelination in ICH rat with intracerebroventricular injection of PBS;C:significant remyelination in ICH rat treated with lentiviral-siRNA of MAG gene.图2 术后21 d脑组织劳克坚牢蓝染色结果

4 siRNA治疗对脑组织MAG蛋白表达的影响

免疫组织化学染色显示，MAG主要位于胼胝体和白质神经细胞的细胞浆内;模型+siRNA组血肿周围组织的MAG表达较模型+PBS组明显下降，见图3。经Western blotting定量分析可见，与模型+ PBS组比较，模型+siRNA组MAG的含量明显降低(P＜0.05)，见图4。

讨论

脑出血是指原发的非外伤性的脑实质内出血，其急性期病死率高，即使幸存，也约有75%不同程度丧失劳动能力，重度致残者占40%以上，给社会和家庭带来了巨大的负担。由于对ICH的发病机制尚未完全阐明，目前临床实践中还无特别有效的治疗方法。近来研究发现，ICH后可引起血肿周围髓鞘和轴索损伤，与维持神经纤维髓鞘结构和功能稳定的MAG等出现明显的改变;由此导致的脱髓鞘损伤是ICH后神经功能缺损的重要原因［2-3，8］。

MAG是一种跨膜糖蛋白，参与髓鞘化的启动及髓鞘化轴突与胶质突起之间稳定连接的维持［9］。研究还发现，MAG在中枢神经系统中有维持髓鞘的完整性和抑制中枢神经系统轴突再生的作用［4-5］;研究表明，通过免疫耗竭法除去MAG后，可明显减少髓鞘对轴突生长的抑制作用［9］。在合适的微环境下可以利于髓鞘的再生，即可以通过抑制阻碍再生和增强促进再生的因素来促进神经的再生能力［10］。RNA干扰技术是由双链RNA介导的，在转录后mRNA水平关闭相应基因表达的过程，siRNA具有普遍性、高效性、特异性和记忆性，具有简单、快速关闭特定基因功能的优点［11-12］。本研究通过免疫组化和蛋白定量测定发现，重组慢病毒介导的MAG siRNA治疗脑出血后能显著降低脑组织中MAG蛋白的表达，基因沉默效果明显。这为深入研究MAG在髓鞘损伤的发病机制奠定基础。

Figure 3.Representative images of immunohistochemical staining of myelin-associated glycoprotein(MAG;dark brown) in coronal sections of the ipsilateral internal capsule with intracerebral hemorrhage(ICH)on the 21st day (×100).A:normal rat;B:remarkable demyelination in ICH rat with intracerebroventricular injection of PBS;C:significant remyelination in ICH rat treated with lentiviral-siRNA of MAG gene.图3 术后21 d血肿周围组织MAG的免疫组化结果

Figure 4.Western blotting for myelin-associated glycoprotein (MAG)extracted from the ipsilateral cerebral tissues of rats on the 21st day.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs model+PBS group.图4 Western blotting检测术后21 d血肿周围组织MAG蛋白的表达

研究证实，中枢神经系统髓鞘磷脂中存在MAG轴突生长抑制性蛋白，它的抑制作用一方面与神经节苷脂GD1a和GT1b结合，形成轴索结构，维持轴索的稳定性;另一方面它与Nogo receptor 1(NgR1)/ Nogo receptor 2(NgR2)受体结合，通过RhoA途径，向胞内传递抑制信号，明显抑制突起的生长和生长锥的塌陷，抑制包括少突胶质细胞在内的轴突的生长［13］。本研究通过前期的量效关系预实验发现，采用1×1011cfu/L的慢病毒MAG基因siRNA为最佳干扰剂量。因此，本研究采用该剂量siRNA能有效沉默MAG的表达，而且沉默MAG的表达后神经纤维的修复较对照组明显好转，表现在行为学上大鼠的运动功能得到显著改善。因此，本研究认为，siRNA沉默MAG后能逆转MAG抑制髓鞘再生的作用，从而有助于神经纤维髓鞘再生，达到改善神经缺失的目的。

［1］Thanvi BR，Sprigg N，Munshi SK.Advances in spontaneous intracerebral haemorrhage［J］.Int J Clin Pract，2012，66(6):556-564.

［2］Liu AM，Lu G，Tsang KS，et al.Umbilical cord-derived mesenchymal stem cells with forced expression of hepatocyte growth factor enhance remyelination and functional recovery in a rat intracerebral hemorrhage model［J］.Neurosurgery，2010，67(2):357-366.

［3］刘安民，罗铭，蔡望青，等.转肝细胞生长因子的脐带间质干细胞移植促进大鼠脑出血后髓鞘再生［J］.中国病理生理杂志，2009，25(10):1936-1940.

［4］Yiu G，He Z.Glial inhibition of CNS axon regeneration ［J］.Nat Rev Neurosci，2006，7(8):617-627.

［5］Mimura F，Yamagishi S，Arimura N，et al.Myelin-associated glycoprotein inhibits microtubule assembly by a Rho-kinase-dependent mechanism［J］.J Biol Chem，2006，281(23):15970-15979.

［6］陈舒，罗铭，蔡望青，等.靶向MAG基因shRNA慢病毒载体的构建及其对MAG基因表达的沉默［J］.中国病理生理杂志，2013，29(9):1725-1728.

［7］刘安民，罗铭，金华伟，等.胶原酶诱导不同部位脑出血大鼠模型的神经功能比较［J］.中华实验外科杂志，2008，25(5):615-616.

［8］Wasserman JK，Schlichter LC.White matter injury in young and aged rats after intracerebral hemorrhage［J］.Exp Neurol，2008，214(2):266-275.

［9］McKerracher L，David S，Jackson DL，et al.Identification of myelin-associated glycoprotein as a major myelinderived inhibitor of neurite growth［J］.Neuron，1994，13 (4):805-811.

［10］Demjen D，Klussmann S，Kleber S，et al.Neutralization of CD95 ligand promotes regeneration and functional recovery after spinal cord injury［J］.Nat Med，2004，10(4): 389-395.

［11］Bakhtiyari S，Haghani K，Basati G，et al.siRNA therapeutics in the treatment of diseases［J］.Ther Deliv，2013，4(1):45-57.

［12］万璟，李小毛，舒珊荣，等.慢病毒介导的靶向沉默胰岛素样生长因子1型受体的siRNA对人子宫内膜癌细胞迁移和侵袭能力的影响［J］.中国病理生理杂志，2012，28(8):1352-1357.

［13］Schnaar RL，Lopez PH.Myelin-associated glycoprotein and its axonal receptors［J］.J Neurosci Res，2009，87 (15):3267-3276.

Therapeutic effect of MAG gene silencing by siRNA on remyelination and motor recovery after intracerebral hemorrhage in rats

LIU An-min1，LUO Ming2，CAI Wang-qing1，CHEN Shu1，HE Ming-liang1，PAN Weisheng3
(1Department of Neurosurgery，2Department of Oncology，Sun Yat-sen Memorial Hospital，Sun Yat-sen University，Guangzhou 510120，China;3Chinese University of Hongkong，Hongkong，China.E-mail:drliuam@aliyun.com)

AIM:To study the functional rehabilitative effects of lentiviral vector-mediated siRNA silencing myelin-associated glycoprotein(MAG)on neurological improvement and remyelination after intracerebral hemorrhage (ICH)in rats.METHODS:ICH was induced in 45 adult male Sprague-Dawley rats by a stereotactically guided injection of bacterial type IV collagenase into the right internal capsule.Lentiviral vector-mediated siRNA targeting MAG(siRNA)，or PBS was administered left intracerebroventricularly 1 d after right internal capsule ICH.The Rotarod motor test scores were determined 1 d before and 1 d，7 d，14 d and 21 d after treatment.Luxol fast blue staining，immunohistological staining and Western blotting were used to detect the changes of MAG.RESULTS:Compared with PBS group，the changes of Rotarod motor test scores indicated that the ICH rats receiving siRNA had significant functional recoveries.As indicated by Luxol fast blue staining，the area of demyelination in percentage was obviously reduced in siRNA treatment group as compared with PBS group after ICH(P＜0.05).The expression of MAG detected by immunohistological staining and Western blotting was significantly lower in siRNA-treated brain than that in PBS group(P＜0.05).CONCLUSION:siRNA targeting MAG contributes to the remarkable functional recovery after ICH.The treatment promotes nerve fiber remyelination by down-regulation of the MAG expression after ICH in rats.

Myelin-associated glycoprotein;RNA inference;Remyelination;Intracerebral hemorrhage;Rats

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2014.02.014

1000-4718(2014)02-0274-04

2013-09-23

2013-12-04

广东省自然科学基金资助项目(No.S2011010002638);广东省科技社会发展项目(No.2012B031800356)

△通讯作者Tel:020-81332016;E-mail:drliuam@aliyun.com