沉默NANOG表达对人肝癌细胞HepG2中cyclin D1表达及细胞增殖的影响*

周嘉嘉，陈汝福，邓小耿，周雨，周泉波，张杰，伍耀豪，曾乐祥，邱荣林

(中山大学孙逸仙纪念医院外科，广东广州 510120)

沉默NANOG表达对人肝癌细胞HepG2中cyclin D1表达及细胞增殖的影响*

周嘉嘉，陈汝福△，邓小耿，周雨，周泉波，张杰，伍耀豪，曾乐祥，邱荣林

(中山大学孙逸仙纪念医院外科，广东广州 510120)

目的:探讨RNA干扰沉默NANOG表达后对肝癌细胞HepG2中细胞周期素D1(cyclin D1)表达及细胞增殖的影响。方法：将以NANOG基因为靶点的NANOG-siRNA瞬时转染肝癌细胞HepG2，real-time PCR和Western boltting检测NANOG、cyclin D1 mRNA和蛋白的表达，CCK-8和平板克隆形成实验检测细胞增殖能力，流式细胞术检测细胞周期情况。结果:与mock组比较，转染NANOG-siRNA后，肝癌细胞HepG2中NANOG、cyclin D1 mRNA和蛋白水平均下调(P＜0.05)，细胞增殖能力下降(P＜0.05)，进入G0/G1期的细胞比例增多(P＜0.05)。结论:沉默NANOG表达可引起肝癌细胞HepG2中cyclin D1的表达下降，导致细胞增殖能力下降。

肝肿瘤;NANOG蛋白;细胞增殖;细胞周期蛋白D1

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是临床上最常见的恶性肿瘤之一，据统计全世界每年新发肝癌患者约60万，居恶性肿瘤的第5位。目前我国发病人数约占全球的半数以上，占全球肝癌病人的55%，严重威胁国人的健康和生命。NANOG是近年来发现的一个维持胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESCs)自我更新和多向分化潜能的重要转录因子，是干细胞具有发育成各种类型细胞能力的“总开关”，被认为是全能性或多能性干细胞的标志物［1-3］。研究发现NANOG在乳腺癌、前列腺癌、结肠癌等异常表达，提示NANOG也可能是某些肿瘤的标志之一［4-5］。细胞周期素D1(cyclin D1)作为重要的细胞周期调节因子之一，其过度表达是多种人类原发性肿瘤的特征，对肿瘤的诊断和预后判断具有重要意义［6］。Cyclin D1蛋白表达增加主要见于一些原发性恶性肿瘤，例如乳腺癌、肝细胞癌［6-7］。本研究通过RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术沉默肝癌细胞HepG2中NANOG的表达，探讨其对肝癌细胞cyclin D1表达以及肝癌细胞增殖活性的影响。

材料和方法

1 材料

人肝癌细胞株HepG2由本实验室保存，RPMI-1640培养基及胰蛋白酶购自Gibco;脂质体2000(LipofectamineTM2000)购自Invitrogen;NANOG和cyclin D1兔抗人单克隆抗体购自CST;总RNA提取试剂Trizol购自Invitrogen;real-time PCR试剂盒购自TaKaRa;CCK-8试剂购自日本同仁化学研究所。

2 方法

2.1 细胞培养及转染HepG2细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中，置于37℃、5% CO2和相对湿度95%的恒温培养箱中培养，1～2 d换液。取对数生长期HepG2细胞，接种于6孔培养板中，培养24 h后待细胞融合达85%左右时进行细胞转染。转染前2 h更换不含血清的新鲜培养基。设计siRNA干扰序列靶点:GFP 5’-ACT ACC TGT TCC ATG GCC A-3’;NANOG 5’-CCA GAC CTG GAA CAA TTC A-3’;由广州锐博生物公司合成。实验分组:以无血清培养基培养+脂质体2000处理组(以下简称mock组);脂质体2000转染GFP-siRNA组(以下简称siGFP组);脂质体2000转染NANOG-siRNA组(以下简称siNANOG组)。按脂质体2000转染试剂盒说明书进行细胞转染，24～48 h后收集细胞进行后续实验。如接种在96孔板中，按说明书相应地调整细胞数及转染试剂量。

2.2 Real-time PCR检测NANOG mRNA表达细胞转染24 h后，Trizol法提取各组细胞总RNA，紫外分光光度计检测RNA浓度及纯度。按real-time PCR试剂盒操作说明书合成cDNA。NANOG(109 bp)上游引物5’-CAG AAG GCC TCA GCA CCT AC-3’，下游引物5’-TGG CAC CCA GCA CAA TGA A-3’;βactin(186 bp)上游引物5’-ATT GTT CCA GGT CTG GTT GC-3’，下游引物5’-CTA AGT CAT AGT CCG CCT AGA AGC A-3’。PCR反应条件:95℃20 s，95 ℃10 s，60℃30 s，70℃10 s，35个循环。所有标本均重复检测3次，计算出Ct值，采用2-ΔΔCt法进行计算分析。

2.3 Western blotting测定NANOG和cyclin D1蛋白的表达细胞转染48 h后，按说明书提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。配制10%SDS-PAGE凝胶，各上样孔加入25 μg蛋白样品，电泳后转印至硝酸纤维素膜(PVDF)膜上。PVDF膜以50 g/L脱脂奶粉封闭2 h。分别加入NANOG和cyclin D1兔抗人单克隆Ⅰ抗(1∶1 000)于4℃孵育过夜。经TBST漂洗3次后，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔Ⅱ抗(1∶5 000)，室温孵育1 h，TBST漂洗3次，ECL化学发光法试剂盒显影、曝光。经Bio-Rad公司图形分析软件Quantity One对图片进行分析并测定灰度值。

2.4 CCK-8法检测细胞增殖情况取对数生长期HepG2细胞，接种于96孔板，培养24 h，转染siRNA。细胞转染后12 h、24 h、36 h、48 h、60 h和72 h，更换为不含血清的新鲜培养基，并加入10 μL CCK-8试剂。置于37℃孵育2 h，用酶标仪测定450 nm的吸光度，每个时点每组设5个复孔。

2.5 平板克隆形成实验细胞转染24 h后，将细胞用胰酶消化后吹散成单细胞悬液，取500个细胞接种于培养皿中，每组设3个重复孔。于37℃、5% CO2和相对湿度95%的恒温培养箱中培养7d。用多聚甲醛固定，1%结晶紫染色。显微镜下计算克隆形成数(含有10个细胞以上的集落为1个克隆)，克隆形成率(%)=克隆形成数/接种细胞数×100%。

2.6 流式细胞术测定细胞周期细胞转染48 h后，收集细胞，用PBS制备成单细胞悬液，用75%乙醇4℃固定过夜，固定后细胞经PBS洗涤2次。避光条件下加入PI染液，室温孵育30 min，上流式细胞仪分析样品，测定细胞周期。

3 统计学处理

数据用均数±标准差(mean±SD)表示，用SPSS 13.0统计软件进行分析，组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1 RNAi对NANOG表达的影响

Real-time PCR检测显示，siNANOG组NANOG mRNA表达水平均较mock组明显下降，比值为0.340±0.055，差异有统计学意义(P＜0.05); siGFP组与mock组相比NANOG mRNA表达水平无明显差异，比值为0.980±0.038(P＞0.05)，见图1。Western blotting结果显示，siNANOG组NANOG蛋白表达水平较mock组明显下降，灰度比值为0.430±0.077，差异有统计学意义(P＜0.05);siGFP组与mock组的NANOG蛋白表达水平则无明显差异，灰度比值为0.960±0.047(P＞0.05)，见图2。

Figure 1.NANOG mRNA expression in HepG2 cells.Mean± SD.n=3.*P＜0.05 vs mock.图1 HepG2细胞中NANOG mRNA的表达

Figure 2.NANOG protein expression in HepG2 cells.Mean± SD.n=3.*P＜0.05 vs mock.图2 HepG2细胞中NANOG蛋白的表达

2 NANOG对细胞生长曲线的影响

CCK-8实验结果显示，siNANOG组细胞在48～72 h吸光度值显著低于mock组，差异有统计学意义(P＜0.05);siGFP组与mock组相比无显著差异(P＞0.05)，见图3。

3 NANOG对细胞克隆形成的影响

各组克隆形成率:siNANOG组为(7.4±3.8)%，siGFP组为(16.8±2.5)%，mock组为(17.3± 2.2)%。siNANOG组细胞克隆形成率低于mock组，差异有统计学意义(P＜0.05);siGFP组与mock组细胞克隆形成率无明显差异(P＞0.05)，见图4。

Figure 3.Proliferation curves of HepG2 cells.Mean±SD.n= 5.*P＜0.05 vs mock.图3 HepG2细胞增殖曲线

Figure 4.Flat plate colony formation assay of HepG2 cells.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs mock.图4 HepG2细胞的克隆形成率

4 NANOG对细胞周期的影响

流式细胞术结果显示，与mock组细胞G0/G1期(57.8±5.05)%相比，siNANOG组细胞G0/G1期百分比升高，为(74.6±8.21)%，S+G2/M期细胞数相应下降，差异有统计学意义(P＜0.05)。siGFP组与mock组细胞G0/G1期百分比无明显差异(P＞0.05)，见图5。

5 NANOG对cyclin D1蛋白表达的影响

Real-time PCR检测显示，采用siRNA抑制NANOG表达后siNANOG组细胞cyclin D1 mRNA表达水平均较mock组明显下降，比值为0.390± 0.067，差异有统计学意义(P＜0.05);siGFP组与mock组相比，cyclin D1 mRNA表达水平则无明显差异，比值为0.950±0.054(P＞0.05)，见图6。Western blotting结果显示，siNANOG组的cyclin D1蛋白表达水平较mock组明显下降，灰度比值为0.400±0.075，差异有统计学意义(P＜0.05);siGFP组与mock组的cyclin D1蛋白表达水平则无明显差异，灰度比值为0.920±0.063(P＞0.05)，见图7。这表明RNAi沉默NANOG表达后降低HepG2细胞中cyclin D1 mRNA和蛋白的表达。

Figure 5.Cell cycle assay of HepG2 cells.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs mock.图5 HepG2细胞的细胞周期情况

Figure 6.Cyclin D1 mRNA expression in HepG2 cells.Mean± SD.n=3.*P＜0.05 vs mock.图6 HepG2细胞中cyclin D1 mRNA的表达

Figure 7.Cyclin D1 protein expression in HepG2 cells.Mean ±SD.n=3.*P＜0.05 vs mock.图7 HepG2细胞中cyclin D1蛋白的表达

讨论

2003年Chambers和Mitsui几乎同时报道了一种在囊胚内细胞群、原始生殖细胞及胚胎干细胞系表达的新转录因子，命名为NANOG，意即“生命绿洲”和“永不枯竭”［1-2］。在ESCs中，NANOG可特异性结合下游靶基因启动子区域ATTA结合元件，发挥转录调节作用，维持ESCs自我更新和多向分化潜能［3，8］。最初以为NANOG只在胚胎干细胞、胚胎生殖细胞以及胚胎癌细胞等多能性细胞中表达，在正常成体组织中不表达。近年研究发现NANOG在精原细胞瘤、乳腺癌、前列腺癌和视网膜母细胞瘤等异常表达［4-5，9-10］。实验证实，将NANOG基因转入造血干细胞后，引起了γδT细胞恶性肿瘤的发生，研究者认为NANOG是一种癌基因，可导致恶性转化［11］。外源表达NANOG能促进NIH3T3细胞增殖，使细胞生长速度加快［12］。研究还发现，NANOG还与肿瘤进展有关:下调NANOG表达可阻止肿瘤恶性进展，在某些情况下，改变了细胞分化［4］。本研究结果显示，以未处理的mock组作为对照，肝癌细胞HepG2在转染NANOG-siRNA后，NANOG mRNA和蛋白表达水平均显著下降;细胞生长曲线及克隆形成实验显示，下调NANOG表达后HepG2细胞增殖能力减弱，增殖速度下降，而转染GFP-siRNA 的HepG2细胞和mock组之间没有明显差异，表明下调NANOG表达可抑制肝癌细胞HepG2的细胞增殖。

细胞周期是细胞生命活动的基本过程，主要分为4个时期G1期、S期、G2和M期，遵循G1-S-G2-M演变规律，其中G1/S和G2/M为2个重要的检查点，而前者尤为重要。细胞一旦从G1跨入S则不再依靠外来信息刺激而自动完成分裂过程［13］。在G1/S期，cyclin D1是G1期进展的限速控制因素，在调控细胞增殖及细胞周期进程中有重要意义［6］。软件分析发现cyclin D1基因启动子区域存在2个以上ATTA结合元件，这为NANOG直接调控cyclin D1基因的转录和表达提供了可能。本研究结果显示，转染NANOG-siRNA后，cyclin D1 mRNA和蛋白表达水平均显著下降，转染GFP-siRNA的细胞和mock组之间则没有明显差异，表明下调NANOG表达可以降低肝癌细胞HepG2中cyclin D1蛋白的表达水平，NANOG可能是通过特异性结合cyclin D1基因启动子区域ATTA结合元件而发挥转录调控活性的。流式细胞术结果显示，转染NANOG-siRNA后，进入G0/G1期的细胞较mock组明显增多，转染GFP-siRNA的细胞与mock组之间则没有明显差异，表明下调NANOG表达可以调节细胞周期的进程，而下调NANOG表达对细胞增殖及细胞周期的影响主要是通过阻滞细胞周期于G0/G1期实现的，这一功能的实现可能与下调NOANG表达后对cyclin D1的抑制作用有关。

综上所述，通过RNAi技术沉默NANOG表达，可引起人肝癌细胞HepG2中cyclin D1表达的下降，细胞增殖能力的减弱以及细胞周期的改变。NANOG可能是通过作用于cyclin D1基因启动子区域的ATTA结合元件而调节cyclin D1的转录活性，进而下降cyclin D1的表达水平。Cyclin D1可能参与了NANOG对细胞增殖及细胞周期的调控作用。

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Effect of NANOG silencing on cyclin D1 expression and proliferation in human hepatoma HepG2 cells

ZHOU Jia-jia，CHEN Ru-fu，DENG Xiao-geng，ZHOU Yu，ZHOU Quan-bo，ZHANG Jie，WU Yao-hao，ZENG Le-xiang，QIU Rong-lin
(Department of Surgery，Sun Yat-sen Memorial Hospital，Sun Yat-sen University，Guangzhou 510120，China.E-mail: chenrf63@163.com)

AIM:To investigate the effect of NANOG silencing on cyclin D1 expression and proliferation in human hepatoma HepG2 cells.METHODS:Transient transfection of NANOG targeting siRNA into HepG2 cells was performed.The expression of NANOG and cyclin D1 at mRNA and protein levels was detected by real-time PCR and Western blotting.Cell proliferation was examined by CCK-8 assay and colony formation assay，and cell cycle was tested by flow cytometry.RESULTS:After transfection with NANOG-targeting siRNA，the inhibition of NANOG expression was observed.Compared with mock group，the mRNA and protein expression levels of NANOG and cyclin D1 were decreased(P＜0.05).In addition，knockdown of NANOG expression inhibited the cell proliferation and increased the proportion of G0/ G1-phase cells(P＜0.05).CONCLUSION:Silencing of NANOG expression in HepG2 cells causes down-regulation of cyclin D1 expression and decreases the cell proliferation ability.

Liver neoplasms;NANOG protein;Cell proliferation;Cyclin D1

R735.7

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2014.02.009

1000-4718(2014)02-0245-05

2013-09-15

2013-12-02

国家自然科学基金资助项目(No.30872485;No.81000889)

△通讯作者Tel:020-81332020;E-mail:chenrf63@163.com