急性低氧暴露下运动模拟急性高山病发生中血清ACE活性、AngⅡ水平及其基因多态性研究

周文婷　胡扬

摘要：目的：研究急性低氧暴露下运动模拟急性高山病（AMS）发生中血清ACE活性及AngⅡ水平的变化趋势及ACE、AT1R基因多态与其水平的关系。方法：模拟海拔4800 m低氧环境，49名北方汉族大学生急性暴露6 h，其中入舱30 min后以恒定负荷蹬车20 min，LLS量表评价AMS。常氧安静（NM）和急性低氧暴露结束（HY）时测定血清ACE活性及AngⅡ水平。PCR-RFLP法检测受试者ACE基因A-240T、A2350G位点及AT1R基因A1166C位点的基因型和等位基因频率。结果：1）低氧暴露后，AMS组的ACE活性轻微上升，非AMS组轻微下降，两组间的ACE活性变化量（△ACE（HY-NM））差异不显著。两组的AngⅡ水平均下降，但AMS组下降显著，非AMS组下降不显著，两组间的AngⅡ变化量（△AngⅡ（HY-NM））差异不显著。2）不同基因型和等位基因携带者的AMS发生率和AMS评分变化趋势均无显著性差异。低氧暴露前后，不同基因型携带者的ACE活性和AngⅡ水平差异不显著，A2350G位点和A1166C位点不同基因型组间的ACE活性变化量（△ACE（HY-NM））和AngⅡ水平变化量（△AngⅡ（HY-NM））差异也不，但A-240T位点不同基因型组间的ACE活性变化量（△ACE（HY-NM））差异显著。结论：1）血清ACE活性和AngⅡ水平不是急性低氧暴露的敏感指标。2）ACE基因A-240T、A2350G位点及AT1R基因A1166C位点多态性与AMS易感性及AMS评分变化趋势无关。A-240T位点与低氧暴露前后ACE活性变化量（△ACE（HY-NM））有关。

关键词：急性高山病；ACE活性；AngⅡ水平；基因多态

中图分类号：G804.7文献标识码：A文章编号：1006-2076（2014）02-0063-07

Abstract：Objectives：To study the change trend of the serum ACE activity and AngⅡ concentration during the incidence of Acute Mountain Sickness （AMS） simulated by exercise in acute hypoxic exposure and the effects of polymorphisms of ACE and AT1R on the serum ACE activity and AngⅡ

1. Harbin Institute of Physical Education， Harbin 150008， Heilongjiang， China； 2. Beijing Sport University， Beijing 100086， China concentration.Methods：49 students， all male Chinese Han origin lowlanders， were involved in a 6h acute exposure to 4800m altitude equivalent. Within 30 min of arriving at altitude， volunteers exercised at constant work rate for 20min on a cycle ergometer， then rested for the remainder of the 6h altitude exposure. Incidence and severity of AMS symptoms were determined by using the LLS.During the normoxic resting （NM） and at the end of the acute hypoxic exposure （HY）， serum ACE activity and AngⅡ concentration were analyzed. PCR-RFLP was used to determine the genotypes and alleles frequencies of ACE at A-240T， A2350G loci， as well as of AT1R at A1166C loci.Results：1）The serum ACE activity increased slightly in the AMS group after hypoxia exposure， while it decreased slightly in the Non AMS group. No significant differences of the ACE concentration change volume （△ACE（HY-NM）） were found between the two groups.The AngⅡconcentrations of the two groups decreased，but in the AMS group， it decreased significantly；In the Non AMS group， it decreased unremarkably. No significant differences of the AngⅡ concentration change volume （△AngⅡ（HY-NM）） were found between the two groups. 2）At the loci of ACE and AT1R， there were no remarkable differences of the AMS accidences，and the AMS score change trends in different genotypes and alleles after hypoxia exposure. Before and after hypoxia exposure， no significant differences of the ACE activity，and AngⅡ concentration were detected in different genotypes. ACE activity change volumes （△ACE（HY-NM）） were remarkably different in different genotypes at loci A-240T of ACE， while no significant differences of the ACE activity change volumes （△ACE（HY-NM）） and the AngⅡ concentration change volumes （△AngⅡ（HY-NM）） were found in different genotypes， either at loci A2350G of ACE or at loci A1166C of AT1R.Conclusions：1）Serum ACE activity and AngⅡ concentration are not sensitive marks for the acute hypoxia exposure. 2）A-240T， A2350G， as well as A1166C loci.were associated with the incidence of AMS and AMS score change trend. A-240T loci of ACE was associated with the ACE change volume （△ACE（HY-NM）） of hypoxia exposure.

Key words： acute mountain sickness； ACE activity； AngⅡ concentration； polymorphism

近年来，进入高原的人逐渐增多，由于急进高原环境而导致的急性高山病（acute mountain sickness， AMS）问题日渐突出。AMS是包括头痛、恶心、食欲减退、疲倦、眼花及睡眠障碍等症状在内的高原多发病，一旦救治不及时就可能发展为高原肺水肿（HAPE）和高原脑水肿（HACE），危及生命[1]。已知高原缺氧是AMS的触发原因[2]，在高原中的上升高度、上升速度及个体易感性则是影响AMS发生及严重程度的最主要因素[3]。

肾素-血管紧张素系统（renin-angiotensin system， RAS）在心血管系统中作用显著，血管紧张素Ⅱ（anglotensinogen Ⅱ， AngⅡ）是效应肽，血管紧张素Ⅱ受体1（Ang II type 1 receptor， AT1R）是其数量最多的受体，二者结合引起心肌和血管的收缩，调节电解质平衡，引起细胞增生、增殖等[4]，AT1R水平的高低决定了AngⅡ的发挥效应。血管紧张素转化酶（angiotensin converting enzyme， ACE）是RAS中的关键酶，作用是催化无活性的AngⅠ转变为AngⅡ，其水平决定着AngⅡ的生成量。研究表明，低氧会造成机体的血浆醛固酮浓度（plasma aldosterone concentration， PAC）降低，血浆肾素活性升高，导致RAS紊乱。为探究其原因，有人测定了低氧下血浆中ACE的含量，发现低氧会使ACE水平下降，导致AngⅡ减少，从而引起ALD浓度的降低[5]，而高原适应能力较好者的ACE水平往往下降幅度较大[6]。ACE基因A-240T、A2350G位点及AT1R基因A1166C位点是当前AMS及HAPE遗传易感性研究中的热点，被认为与AMS及不同种族人HAPE的发生有关[7-10]。然而，我国北方汉族人群人中上述多态位点与AMS易感性是否关联，若有关联该关联是否与血清ACE活性及AngⅡ的水平及其变化量相关，血清ACE活性及AngⅡ水平在AMS发生中变化趋势如何，迄今尚无相关研究。故本研究以我国世居平原北方汉族男性为对象，在急性低氧暴露中对受试者施以运动模拟AMS的发生，通过分别对ACE及AngⅡ主要受体AT1R的编码基因ACE的A-240T、A2350G位点及AT1R基因A1166C位点进行基因解析，首次对上述问题了进行探索，以期加深对AMS发生机制的理解。

1实验对象和方法

1.1实验对象

49名普通男性大学生参与Phase 1研究，其中48名参与Phase 2研究。受试者身体健康，无神经系统、心肺、心血管系统疾病及吸烟史；均为北方汉族世居平原者（海拔<800 m）。实验前6个月未经高原和（或）低氧暴露（海拔≥1 500 m）。受试者基本情况和生活方式均较为相似，基本情况见表1，实验前填写PARQ问卷，签署知情同意书。正式实验前熟悉测试仪器和实验流程至少2次。

1.2方法

1.2.1实验方案

Phase 1：在低氧舱（模拟海拔4 800 m，F1O2 10.4%～10.8%，温度20℃～24℃，相对湿度46%～67%，气压1014 hPa～1021 hPa）中受试者暴露6 h，其中进舱后休息30 min，而后运动30 min：在卧式功率车上仰卧休息5 min后，以恒定负荷（80 W， 60 rpm）蹬车20 min，恢复5 min，运动终止标准参照[10]。运动结束后，受试者在剩余时间内静息暴露。于低氧暴露第0.5 h、2 h、4 h和6 h用LLS量表评价AMS[11]，当受试者出现头痛症状且AMS评分≥3时，被认为出现AMS[12]，6 h低氧暴露结束时AMS评分≥3者定为AMS组，其他受试者为非AMS组。

受试者分别于常氧安静（NM）和急性低氧暴露结束（HY）时取8 ml静脉血。分装2 ml于含10% EDTA-Na2和抑肽酶 10 ul（100U/ml）的试管中，分离血浆，-20℃保存。测试前将样本置于室温复融，4℃，3 000 rpm离心5 min，取上清，RIA法测定血清AngⅡ水平，ELISA法测定血清ACE 活性。

静脉血5 ml，分离白细胞，以Promega公司试剂盒提取基因组DNA。PCR-RFLP法解析ACE基因A-240T、A2350G位点及AT1R基因A1166C位点基因型。PCR扩增引物序列及反应条件见表2。

1.2.2统计方法

以平均值±标准差（±s）描述AMS评分、血清ACE活性及AngⅡ水平；基因型及等位基因频率差异用χ2检验；各组常氧安静时的血清ACE活性及AngⅡ水平差异采用独立样本t检验，低氧暴露前后的ACE活性、AngⅡ水平差异及ACE活性与AngⅡ水平变化量差异（△ACE（HY-NM）与△AngⅡ（HY-NM））采用配对t检验；不同组间ACE活性与AngⅡ水平变化量的差异（△ACE（HY-NM）与△AngⅡ（HY-NM））以NM时的相应基础值为协变量，进行协方差分析；低氧暴露中，不同基因型组间的AMS评分在各时间点的变化趋势数据符合正态分布并具方差齐性时，采用双因素重复测量方差分析（基因型×测试时间点），后续比较采用Holm-Sidak检验；若数据不符合正态分布，组内比较采用Kruskal-Wallis检验，组间比较采用Mann-Whitney秩和检验。SPSS 17.0软件包统计分析，非常显著性水平与显著性水平分别定为0.01和0.05。

2结果与分析

2.1急性低氧暴露下运动对AMS与血清ACE活性及AngⅡ水平的影响

低氧暴露后，AMS组与非AMS组的AMS评分分别为3.9±1.2和1.2±0.9，55.1%的受试者发生AMS，评分区间为0～10。两组受试者在NM时的血清ACE活性及AngⅡ水平差异均不显著；HY时，两组的ACE活性与NM时相比均无差异性变化，两组间的ACE活性变化量（△）差异也不显著。AMS组与非AMS组的AngⅡ水平在HY时均出现下降，但AMS组下降显著（P<0.05），非AMS组下降不显著，两组间的AngⅡ变化量（△）差异也不显著（见表3）。

2.2急性低氧暴露下运动对AMS与血清ACE活性及AngⅡ水平影响的多态研究

受试者各多态位点的基因型和等位基因分布均符合H–W平衡（P<0.05）。在ACE基因的A2350G、A-240T位点及AT1R基因的A1166C位点，不同基因型和等位基因携带者的AMS发生率则均无显著性差异（见表4）。

不同低氧暴露时间对AMS评分变化趋势的影响差异均非常显著（P<0.01），受试者的AMS评分均随暴露时间的延长而逐渐上升，暴露6 h时最高，而各多态位点不同基因型对受试者AMS评分变化趋势的影响差异均不显著（见表5）。

AT1R基因A1166C位点的不同基因型携带者NM时的血清AngⅡ水平显著不差异；急性低氧暴露后，不同基因型携带者的血清AngⅡ水平均下降，但差异均不显著，不同基因型携带者的血清AngⅡ变化量（△）无显著性差异（见表6）。

在ACE基因的A-240T位点及A2350G位点，不同基因型携带者在NM时的血清ACE活性差异均不显著；急性低氧暴露后，不同基因型携带者的血清ACE活性变化均不显著，A-240T位点不同基因型携带者间的ACE活性变化量（△）有显著性差异（P<0.05），而A2350G位点不同基因型携带者间的ACE活性变化量（△）差异不显著（见表7）。

3讨论

3.1低氧暴露剂量的确定

本研究预期将AMS发生率控制在～50%的范围，评分控制在～10的范围，使设计达到均衡，既较好地控制数据偏倚和统计效力，又控制AMS症状的严重程度，不致出现急性肺水肿和急性脑水肿等危险情况。通过预实验，发现受试者在模拟海拔4 400 m（F1O2：11.2%～11.7%）暴露6 h辅以30 min恒定负荷（80 W， 60 rpm）运动的情况下会出现AMS症状，但AMS发生率为27%[4]，未达到预期。因现有文献中急性低氧暴露（低压低氧）高度多为4 300 m～4 500 m，短期暴露时间多为8 h～12 h[13-14]，而造成AMS的根本原因是高原环境下的低氧[15]，低压只会加大低氧对机体的刺激，加重AMS症状[14]，却并非导致AMS的主因[15]，因此本研究将模拟海拔高度调整为4 800 m，略高于文献中低压低氧的暴露高度，暴露时间及运动负荷维持预实验不变。结果发现，55.1%的受试者出现AMS，评分区间为0～10，获得了预期的AMS发生率及AMS严重程度，表明本研究的低氧暴露剂量合理，适用于AMS模型的建立。

3.2急性低氧暴露下运动对AMS与血清ACE活性及AngⅡ水平的影响

ACE可将血液或组织中（尤其在肺循环血管内皮表面）无活性的AngⅠ转化为有活性的AngⅡ。AngⅡ通过与其受体（ATR）结合，可收缩血管增加回心血量，并可刺激肾上腺皮质球状带合成和释放醛固酮（aldosterone， ALD），参与机体的水、盐代谢，增加循环血量。因AMS患者有血管机能异常和体内水、盐代谢失衡的症状[1]，所以RAS与AMS间的关系受到广泛关注。有人观察了AMS、HAPE患者及健康者血浆中的血浆肾素活性、AngII和ALD含量，发现AMS及HAPE患者的血浆肾素活性、AngⅡ和ALD均显著高于健康人[1]，提示AMS患者发病时RAS系统活性亢进引起的钠、水潴留在AMS的发病过程中可能起重要作用。Milledge等[13]曾报道称，初上高原时受试者的ACE活性会轻微下降，且ACE活性在高原暴露8天后仍低于平原基础值，直至回到平原约20天才恢复。然而，Milledge等也测试了模拟低氧6 300 m运动前后ACE的活性，结果发现，高原运动前ACE的安静值显著高于平原安静值（P<0.05），且其活性在运动前后无明显变化，所以他们推测低氧对ACE活性无明显影响[13]，与本研究结果一致，即急性低氧暴露前后，受试者的血清ACE活性差异不显著。然而，本研究中HY时受试者的血清AngⅡ水平都出现下降，且AMS组下降显著（P<0.05），但两组间的AngⅡ变化量（△AngⅡ（HY-NM））未见显著性差异，与以往研究结果不一致[13-15]，推测可能与本研究中的低氧剂量不足有关。已知AMS的症状随海拔高度的升高及暴露时间的延长而加重，本研究中受试者仅急性低氧暴露6 h，虽然出现了55.1%的AMS发生率，但均较轻微，未发生钠、水潴留，而多数发现AngⅡ升高的研究，其研究对象的AMS症状都较严重，均出现明显的局部水肿、水潴留等水盐代谢失衡症状[13-15]。因此，对血清AngⅡ水平与低氧剂量和海拔高度间相关性的认识，尚有待进一步研究。

3.3急性低氧暴露下运动对AMS与血清ACE活性及AngⅡ水平影响的多态研究

3.3.1急性低氧暴露下运动对AMS影响的多态研究

ACE基因第16内含子中的Alu片段插入/缺失（I/D）多态对AMS的影响目前研究较多。研究发现，该位点多态与ACE的水平相关[16]，影响不同等位基因携带者的高原适应能力[8]。此后，一系列研究陆续开展，但争议不断，有人发现该位点与AMS易感性或严重程度无关[17]，Tsianos等[18]的研究则发现ID才是AMS的易感基因型。Zhu等[19]分析了ACE基因的13个多态位点后发现，A-240T和A2350G多态位点分别可导致6%和19%的血浆ACE水平改变，以A2350G位点的作用进行调整后发现，I/D位点不再与ACE血浆水平相关，故认为I/D并非ACE的功能性多态位点，而是与A2350G位点间连锁不平衡的结果。现已发现，遗传决定了AT1R的编码和非编码区，导致不同的剪切，其中与临床关系最密切的是A1166C位点突变。A1166C位于3非编码区的5端，不影响开放阅读框，所以该位点不产生功能性改变，也不直接影响mRNA的稳定性，但该位点对AngⅡ具有两方面影响[20]：首先，该突变可增加AT1R对AngⅡ的反应性，其中C等位基因与增加动脉壁对AngⅡ的反应、影响血管舒缩功能有关，这种反应的增加可能使C等位基因增加AT1R的数目和受体的亲和力；其次，该突变可影响AT1R基因对AngⅡ的调节， 即该突变可能与一种影响AT1R转录、翻译或影响mRNA的稳定性的蛋白因子基因共分离，从而影响了AT1R的作用。研究发现，不同地区、不同种族的1166C等位基因频率与疾病的关系差异很大[21-22]。本研究中，A1166C位点的AA和AC基因型在所有受试者中的比率为79.6%和20.4%，等位基因A和C的比率为89.8%和10.2%，与本实验室数据库结果基本一致，但与国外的研究结果比较，中国汉族人C等位基因的频率偏低，存在种族差异[23]。A-240T位点的AA和AT+TT基因型在所有受试者中的比率为51.0%和49.0%，等位基因A和T的比率为68.4%和31.6%；A2350G位点的AA和AG+GG基因型在所有受试者中的比率为79.6%和20.4%，等位基因A和G的比率为87.8%和12.2%。其中A-240T和A2350G位点的各基因型和等位基因分布频率与我国北方汉族人相比差异均不显著[24-25]，但与尼泊尔人相比差异显著[10]，表明A-240T和A2350G位点存在种族差异。

本研究对ACE及AT1R基因多态性与AMS易感性的关系进行了探索，结果发现，ACE与AT1R基因的各多态位点不同基因型和等位基因携带者的AMS发生率差异不显著，表明这些位点对AMS的发生无影响。在研究急性低氧暴露阶段各多态位点不同基因型对AMS评分变化趋势的影响时发现，低氧暴露时间对不同基因型携带者的AMS评分变化趋势影响差异均非常显著，而各多态位点对AMS评分变化趋势均无明显影响，未发现上述多态位点与低氧敏感性和低氧适应能力之间存在关联，推测与本研究中的低氧剂量不足有关，故需要进一步研究。

3.3.2急性低氧暴露下运动对血清ACE活性及AngⅡ水平影响的多态研究

本研究发现，HY时AT1R基因A1166C位点不同基因型携带者的AngⅡ水平均轻微下降，但AngⅡ变化量（△AngⅡ（HY-NM））差异不显著。在对受试者心肺功能进行测试时发现，AC基因型携带者的肺功能在低氧暴露阶段受到显著影响，各项指标（VC、FVC和MVV）在低氧暴露结束时比AA基因型携带者显著下降，而在低氧运动过程中，该基因型携带者的肺功能（VC和FVC）、通气指标和HR对低氧和运动的双重刺激也比AA基因型携带者更加敏感（尚未发表），说明AC型携带者的心肺功能比AA型携带者更易受低氧及运动的影响，故表现出较差的低氧耐受能力，这可能也与C等位基因增加动脉壁对AngII的反应，使血管收缩功能加强有关[20]，但由于两种基因型携带者的AMS评分并无显著性差异，因此推测血液中的其他指标对受试者的影响大于该突变对受试者的影响。

在A-240T位点和A2350G位点，HY时不同基因型携带者的ACE活性变化趋势不同，A-240T位点AA基因型和A2350G位点AA基因型携带者的ACE活性均出现上升，AT+TT和AG+GG基因型携带者则出现下降，ACE活性变化量（△ACE（HY-NM））在A-240T位点不同基因型携带者间差异显著，在A2350G位点不同基因型携带者间差异不显著，说明A-240T位点与低氧中的ACE活性变化相关，A2350G和A1166C位点则分别与低氧中ACE活性和AngⅡ水平变化无关。但由于未发现A-240T位点两种等位基因携带者的AMS发生率及评分变化趋势间存在显著性差异，故无法证实何种等位基因与低氧适应能力相关。究其原因，一方面可能与本研究中低氧暴露时间尚短有关，因此≤6h的低氧积累不足以使A-240T和A2350G位点不同基因型组间的差异表现出来；另一方面可能与研究的样本数量、种族和地域因素有关，故需要更多、更深入的研究以明确A-240T和A2350G位点与低氧敏感性及低氧适应能力的关联。

4结论

4.1血清ACE活性和AngⅡ水平不是急性低氧暴露的敏感指标。

4.2ACE基因A-240T、A2350G位点及AT1R基因A1166C位点多态性与AMS易感性及AMS评分变化趋势无关。A-240T位点与低氧暴露前后ACE活性变化量（△ACE（HY-NM））有关。

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