从竹叶中同步提取多糖、茶多酚和黄酮的研究

王文渊，张航航，周振华，2，杨春华，张芸兰

(1.湖南永州职业技术学院，湖南永州 425100;2.中南大学 药学院，湖南 长沙 410013)

竹叶中含有竹叶黄酮、茶多酚、多糖、特种氨基酸以及活性肽、锰、锌、晒等微量元素。竹叶茶多酚、黄酮和竹叶多糖具有抗氧化、抗衰老、防辐射、抗癌变、增强免疫力、降血脂和胆固醇、抗动脉硬化以及抑菌等多种生理功能和作用［1］，是医药、食品、保健品及日化用品等优质安全的基料或功能性添加剂［2］，应用前景广阔，竹叶也因此被国家卫生部批准列入药食两用的天然植物名单。

从竹叶中提取这些活性成分，目前大都采用溶剂浸提、超声提取或超临界萃取等方法，但这些方法存在原料利用率低、生产周期长、能耗高或溶剂残留等问题，妨碍了竹叶中各种功能性成分的高效开发与利用。高压脉冲电场技术作为一种高效节能的非热处理技术，通过细胞膜穿孔效应来增大细胞膜的通透性，从而促进生物活性成分的渗出，具有温升小、能耗低、传递快速、均匀、安全等特点。

本文采用高压脉冲电场技术，成功地从竹叶中同步提取了竹叶黄酮、竹叶茶多酚和竹叶多糖3种活性成分，为充分利用竹叶中的生物活性成分，实现竹叶资源的综合利用和效益最大化提供指导。

1 实验部分

1.1 材料与仪器

竹叶，自采，经永州市药检所王明荣教授鉴定为楠竹叶，采后漂洗晾干、烘干、粉碎，过250 μm筛后于4℃冷藏备用;芦丁对照品(中国药品生物制品检定所);葡萄糖对照品(上海士锋生物科技公司);其他试剂均为分析纯。

LDT-100/4-25型中药高压脉冲电场提取装置;SY-MU2010超滤/微滤系统;FZ-102微型中草药植物粉碎机;2-16PK高速冷冻离心机;UV1601-PC紫外-可见分光光度计;M-50真空抽滤器。

1.2 实验方法

竹叶中竹叶黄酮、多酚和多糖的提取工艺见图1。

图1 竹叶黄酮、多酚和多糖的提取工艺流程图Fig.1 Process flow diagram on extraction

1.3 分析方法

茶多酚的测定采用 GB 8313—1987方法［3］，总黄酮含量的测定按文献［4］的方法，多糖的测定采用文献［5］的方法。各提取成分的提取率按下式计算:提取率=(提取成分的质量/竹叶粉末质量)×100%。

2 结果与讨论

2.1 电场强度对提取率的影响［6］

在脉冲数为8，料液比1∶12(g/mL)，EDTA缓冲液pH 8.5的条件下，电场强度对竹叶黄酮、茶多酚与多糖提取率的影响见图2。

图2 电场强度对竹叶黄酮、茶多酚和多糖提取率的影响Fig.2 Influence of electric field intensity on extraction

由图2可知，当脉冲电场强度从12 kV/cm增加到24 kV/cm时，竹叶黄酮、茶多酚和多糖的提取率均逐渐增大，这是因为电场强度增强，细胞膜的通透性提高，活性成分释放能力增强。电场强度超过24 kV/cm后，黄酮提取率趋于稳定，说明细胞膜、细胞壁已经被不可逆击穿，黄酮类成分渗出趋于完全，而茶多酚和多糖的提取率开始有所下降。因此电场强度选定24 kV/cm较为适宜。

2.2 EDTA缓冲液pH对提取率的影响［7］

在脉冲数为8，料液比1∶12(g/mL)，电场强度24 kV/cm，改变提取介质EDTA缓冲液的pH，进行高压脉冲电场提取，测定竹叶黄酮、茶多酚与多糖的提取率，结果见图3。

图3 缓冲液pH、茶多酚和多糖提取率的影响Fig.3 Influence of buffer solution pH on extraction

由图3可知，缓冲液pH从5.0提高至9.0时，竹叶黄酮、茶多酚与多糖的提取率均随缓冲液pH的增大而增加。竹叶茶多酚和竹叶多糖的提取率分别在pH 8.0和9.0处达到最大值，竹叶黄酮的提取率在pH 9.0之后仍呈上升趋势，但增加缓慢。故EDTA缓冲液的pH选择8.0～9.0。

2.3 料液比对提取率的影响

在脉冲数为8，电场强度24 kV/cm，缓冲液pH 8.5的条件下，料液比对竹叶黄酮、茶多酚与多糖提取率的影响见图4。

图4 料液比对竹叶黄酮、茶多酚和多糖提取率的影响Fig.4 Influence of solid/liquid ratio on extraction

由图4可知，竹叶黄酮、茶多酚与多糖的提取率均随着料液比的增大而提高，料液比超过1∶16，竹叶黄酮与竹叶茶多酚的提取率缓慢攀升;因为竹叶多糖的溶出性能较好，料液比达到1∶12时，提取率已趋于稳定，所以料液比以1∶12～1∶16为宜。

2.4 脉冲数对提取率的影响［8］

在电场强度24 kV/cm，EDTA缓冲液pH 8.5，料液比1∶14(g/mL)的条件下，脉冲数对竹叶黄酮、茶多酚与多糖提取率的影响见图5。

图5 脉冲数对竹叶黄酮、茶多酚和多糖提取率的影响Fig.5 Influence of pulse number on extraction

由图5可知，脉冲数由2增至8时，竹叶黄酮的提取率快速提高并达到最大值，而茶多酚提取率在脉冲数为10时达到最大，之后随着脉冲数的进一步增大，黄酮与茶多酚的提取率都开始减小。这可能是脉冲频率太大，容易导致被提取物结构的破坏，从而使得提取率降低［9］。但竹叶多糖的提取率一直随着脉冲数的增大呈上升趋势，脉冲数＞10时，提取率提高缓慢。综合考虑，脉冲数以8～10个为宜。

2.5 正交实验

根据单因素实验的结果，对电场强度、脉冲数、缓冲液pH、料液比4个因素进行L9(34)正交实验，水平设计及实验结果见表1。

表1 正交实验结果Table 1 Results of L9(34)orthogonal test

续表

由表1可知，影响黄酮提取率的因素主次为电场强度＞料液比＞缓冲液pH＞脉冲数，提取黄酮的工艺以A3B3C3D3组合最佳;影响多糖提取的各因素主次为电场强度＞缓冲液pH＞料液比＞脉冲数，提取多糖条件以A3B2C3D3组合最佳;影响茶多酚提取的各因素主次顺序为电场强度＞缓冲液pH＞脉冲数＞料液比，提取茶多酚以A3B3C2D3组合工艺最优;各因素对提取总量的影响大小依次为电场强度＞缓冲液pH＞料液比＞脉冲数，从提取总量出发，提取工艺以A3B2C3D3组合最佳。可是竹叶黄酮、茶多酚和多糖以及总提取率的最佳提取条件在9个实验号中都未出现，故于各自的最佳组合工艺条件下进行3次平行实验，取平均值，结果见表2。

表2 最佳组合工艺条件下的实验结果Table 2 Results under optimum condition combination process

由表2可知，按各自的最佳工艺进行提取，竹叶黄酮、多糖和茶多酚的提取率以及总提取率均比正交实验中最优值高。因此，可以确定高压脉冲电场提取竹叶中各活性成分的最优工艺条件。提取黄酮的最优工艺是电场强度26 kV/cm，脉冲数10个，料液比1∶16(g/mL)，缓冲液pH 9.0;提取多糖的最优工艺是电场强度26 kV/cm，脉冲数9个，料液比1∶16(g/mL)，缓冲液pH 9.0;提取竹叶茶多酚的最优工艺是电场强度26 kV/cm，脉冲数10个，料液比1 ∶14(g/mL)，缓冲液 pH 9.0。

表3 总提取率的方差分析Table 3 Variance analysis for orthogonal test

由表3可知，电场强度、EDTA缓冲液pH和料液比对总提取率均有显著影响，而脉冲数无显著影响，从能耗和成本考虑，脉冲数可取B1水平。因此，从提取总量来考虑，最佳提取工艺是A3B1C3D3，即电场强度26 kV/cm，脉冲数8个，料液比1∶16(g/mL)，缓冲液 pH 9.0。

2.6 与传统水浸提法的比较

高压脉冲电场法与传统水浸提法单独提取竹叶多糖、乙醇超声浸提茶多酚［10］、微波辅助提取竹叶黄酮［11］比较，竹叶黄酮与竹叶多糖的提取率分别提高了25.1%和31.6%，但竹叶多酚的提取率则降低了2.4%，这与王白娟等［12］的实验结果趋于一致，原因是酚酸类成分经过高压脉冲电场处理，部分结构破坏，致使有小部分的损失。

3 结论

高压脉冲电场法提取竹叶黄酮、竹叶茶多酚与竹叶多糖，各成分提取的最优工艺条件是:黄酮:电场强度26 kV/cm，脉冲数10个，料液比1∶16，缓冲液pH 9.0;多糖:电场强度26 kV/cm，脉冲数9个，料液比1∶16，缓冲液 pH 9.0;茶多酚:电场强度26 kV/cm，脉冲数10个，料液比1∶14，缓冲液 pH 9.0;提取总量:电场强度26 kV/cm，脉冲数8个，料液比1 ∶16，缓冲液pH 9.0。

［1］李飞跃，喻国光，陈金珠，等.竹叶主要化学成分分析及其生物活性研究现状［J］.江西林业科技，2006(4):34-36.

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