正交实验设计优化血脉疏通口服液水提工艺

易生富，陈兵，孙亚楠

(1.湖北中医药高等专科学校，荆州 434020;2.湖北省荆州市中医院药剂科，荆州 434010)

正交实验设计优化血脉疏通口服液水提工艺

易生富1，陈兵2，孙亚楠1

(1.湖北中医药高等专科学校，荆州 434020;2.湖北省荆州市中医院药剂科，荆州 434010)

目的 优化血脉疏通口服液水提工艺。方法以加水量、煎煮时间、煎煮次数为考察因素进行正交实验,采用3因素3水平正交设计,以黄芪甲苷、总多糖及80%醇浸出物量作为指标值。结果煎煮次数和加水量对黄芪甲苷、总多糖及80%醇浸出物量具显著影响,优选煎煮提取工艺为煎煮3次,加12倍量水,煎煮0.5 h。结论该实验确定了血脉疏通口服液的最佳提取工艺。

血脉疏通口服液；正交实验；水提工艺；黄芪甲苷

血脉疏通口服液为湖北省荆州市中医院自制中药制剂(自制制剂批准文号:鄂药制字Z20110885),由赤芍、黄芪、牛膝、防风、桃仁、地龙、葛根、石菖蒲等组成,具益气、活血、通脉的作用,用于治疗因气虚血瘀所致的冠心病、心绞痛及脂肪肝有很好疗效,治疗冠心病、心绞痛患者70例,总有效率93.33%;治疗脂肪肝患者176例,总有效率89.16%[1-2]。方中牛膝、黄芪、赤芍、葛根、桃仁等药含皂苷类、黄酮类和多糖类,考虑水煎煮法提取;石菖蒲、防风含挥发油,在提取挥发油后,再与赤芍、黄芪、牛膝、葛根、桃仁等药合煎。为了保证制剂质量,笔者在本实验中采用正交实验设计法,优化血脉疏通口服液煎煮提取工艺。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Waterse-2695高效液相色谱仪,Empower工作站,Waters-2424蒸发光散射检测器(美国沃特士公司);Ohaus-AR124CN型电子分析天平(奥豪斯仪器上海有限公司);UV-3000型可见紫外分光光度计(日本岛津);高速离心机(美国MICRO12-24)。

1.2 试药 黄芪甲苷对照品(中国食品药品检定研究院,批号:110683-200916),血脉疏通口服液(自制,批号:20120119,规格:每支10 mL),乙腈为色谱纯,葡萄糖对照品(中国食品药品检定研究院,批号:110976-200903),其他试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 样品的制备 按处方比例,称取石菖蒲6 g、防风8 g,按提油工艺提油,滤过得药液和药渣备用。按处方比例,称取黄芪30 g、赤芍10 g、牛膝10 g、桃仁8 g、葛根10 g、地龙8 g与石菖蒲、防风提油后的药渣混合,按规定的加水量、煎煮时间、煎煮次数提取、过滤、浓缩并定容至100 mL(每毫升含生药0.9 g)。

2.2 单因素实验 按“2.1”项样品的制备方法,分别调整加水量8,10,12,14倍,煎煮时间0.5,1.0,1.5, 2.0 h,煎煮次数1,2,3,4次,进行单因素实验。

2.2.1 加水量的影响 在煎煮时间为1 h,煎煮1次,加水量从8倍增加到12倍时,总多糖含量、黄芪甲苷含量、80%醇浸出物量增加较多。但当加水量增至14倍后,总多糖含量、黄芪甲苷含量近乎没有变化,80%醇浸出物量增加缓慢。因此,加水量应选定为约12倍宜。

2.2.2 煎煮次数的影响 在加水量为12倍,煎煮时间1 h,随着煎煮次数的增加,总多糖含量、黄芪甲苷含量、80%醇浸出物量相应增加。当煎煮次数增加到4次以后,总多糖含量、黄芪甲苷含量增加缓慢,80%醇浸出物量有增加但杂质增加较多。因此煎煮次数选为3次宜。

2.2.3 煎煮时间的影响 在加水量为12倍,煎煮3次的条件下,随着煎煮时间的延长,总多糖含量、黄芪甲苷含量、80%醇浸出物量增加缓慢,考虑到节约工时,煎煮时间选为0.5 h。

2.3 正交实验设计 选取煎煮时间、加水量、煎煮次数3个因素,各取3个水平进行L9(34)正交实验。黄芪是方中君药,黄芪甲苷是其主要有效成分,以黄芪甲苷含量评价指标,权重系数定为0.5;黄芪中多糖为有效成分,方中牛膝、葛根、防风也含有多糖,因此总多糖含量作为另一个评价指标,权重系数定为0.3;80%醇浸出物为大类成分作为间接控制的指标,权重系数定为0.2,以此筛选最佳提取工艺[3]。综合评分=0.5×黄芪甲苷含量+0.3×总多糖含量+0.2×80%醇浸出物量。正交实验表见表1,2。

2.4 黄芪甲苷的含量测定

2.4.1 分析方法的选择 黄芪甲苷含量测定方法文献报道有高效毛细管电泳法、薄层扫描法、高效液相色谱-蒸发光散射检测法、半高效液相色谱-质谱串联法等[4-7]。本实验采用HPLC-ELSD检测法[8]。

表1 正交实验因素水平表

2.4.2 色谱条件 色谱柱:Kromasil C18柱(250 mm× 4.6 mm,5 μm);流动相:乙腈-水(35∶65);检测器:蒸发光散射检测器200 s;柱温35℃;漂移管温度65℃;气体流量:1 L·min-1;进样量:10 μL;理论板数按黄芪甲苷峰计算应不低于3 000。

2.4.3 对照品溶液的制备 精密称取干燥至恒重的黄芪甲苷标准品2 mg于10 mL量瓶,用甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀即可得到0.2 mg·mL-1对照品溶液。

2.4.4 供试品溶液的制备 精密吸取各正交实验样品溶液10 mL,用水饱和的正丁醇振摇提取3次,每次20 mL,合并正丁醇液,用氨试液洗涤2次,每次20 mL,弃去氨液,正丁醇液水浴蒸干,残渣加水5 mL使溶解,通过D101型大孔吸附树脂(内径1.5 cm,长12 cm),用水50 mL洗脱,弃去水液,再用40%乙醇30 mL洗脱,弃去40%乙醇洗脱液,继用70%乙醇50 mL洗脱,收集洗脱液,蒸干,用甲醇溶解并转移至2 mL量瓶,加甲醇至刻度,摇匀即得[9-10]。

2.4.5 标准曲线的绘制 精密量取对照品溶液1,2, 4,6和8 mL分别置于10 mL量瓶,分别加甲醇稀释定容,摇匀,即得0.02,0.04,0.08,0.12和0.16 mg·mL-1对照液。取以上溶液各20 μL注入高效液相色谱仪,记录色谱峰。以峰面积(Y)与浓度(X,μg·mL-1)进行回归,绘制标准曲线,得回归方程:Y=58 102X+1 052.7,r=0.999 3(n=5)。结果表明,样品在0.4～3.2 μg·mL-1浓度范围内,浓度与峰面积呈良好的线性关系。

2.4.6 阴性干扰的判断 照供试品溶液的制备方法制备缺黄芪的阴性对照品溶液,依照上述色谱条件进行测定,供试品溶液色谱图中,在与对照品溶液色谱图相应的位置上有相同的色谱峰,而阴性对照品溶液无相应的色谱峰。

2.4.7 精密度实验 对已配制的1.6 μg·mL-1黄芪甲苷标准品溶液,在色谱条件下连续进样5次,分别测定峰面积,计算RSD为0.58%(n=5)。

2.4.8 稳定性实验 取供试品溶液,分别在0,2,4, 6,8,10,12 h测定进样10 μL,记录峰面积,计算RSD,结果RSD为0.47%(n=7),表明供试品溶液在12 h内稳定。

2.4.9 重复性实验 取1.6 μg·mL-1黄芪甲苷标准品溶液5份,在色谱条件下进样测定峰面积,RSD为0.53%(n=5),重复性良好。

2.4.10 加样回收率实验 量取供试品溶液20 μL5份,各加入不同量的对照品溶液,按“2.4.5”项方法测定峰面积,计算回收率。结果见表3。平均加样回收率98.8%,RSD=1.02%。

2.4.11 样品含量测定 精密量取各供试品溶液20 μL注入高效液相色谱仪,在色谱条件下记录色谱峰,将峰面积代入回归方程中,得到溶液中黄芪甲苷的浓度,进一步计算得到黄芪甲苷的含量。结果见表2。

2.5 总多糖含量测定 总多糖含量测定方法文献报道有蒽酮-硫酸法、苯酚-硫酸法、3,5-二硝基水杨酸法(DNS法)等[11-13]。笔者在本实验中采用苯酚-硫酸法。

2.5.1 对照品溶液的制备 精密称取105℃干燥至恒重的无水葡萄糖标准品60 mg置于100 mL量瓶,加纯化水溶解至刻度,即得0.6 mg·mL-1对照品溶液。

2.5.2 苯酚溶液的配制 精密称取苯酚4.0 g于100 mL量瓶,加水溶解至刻度,即得4%苯酚溶液,移至棕色瓶中保存。

2.5.3 标准曲线的绘制 精密量取对照品溶液0.0, 1.0,1.5,2.0,3.0,4.0 mL分别转移到50 mL量瓶,加水稀释至刻度,摇匀。精密量取上述各溶液2.0 mL置10 mL具塞试管,分别精密加入4%苯酚溶液1.0 mL,摇匀,迅速精密加入浓硫酸7.0 mL,摇匀,沸水保温15 min,取出后迅速用冷水冷却至室温,以第一份为空白对照液,在400～600 nm波长范围内扫描,得最大吸收波长为487 nm。在487 nm波长处,测定各对照品吸光度,以浓度(Y)为横坐标、吸光度(X)为纵坐标绘制标准曲线,回归方程为Y=0.022 6X+0.008 9,r= 0.999 6(n=5)。

2.5.4 样品溶液的配制 精密吸取各样品浓缩液,加无水乙醇4 mL,边加边振摇,使含醇量达80%, 2 000 r·min-1离心20 min,沉淀以水溶解,转移到50 mL量瓶,加水稀释至刻度,摇匀。

2.5.5 精密度实验 按“2.5.3”项方法重复测定同一浓度葡萄糖对照品溶液5次,计算测定结果RSD为0.61%。

2.5.6 稳定性实验 取样品溶液,按“2.5.3”项方法在室温每隔30 min测定一次,连续3 h考察其稳定性,计算测定结果的RSD为1.21%。

表2 正交实验结果表

2.5.7 样品含量测定 精密吸取项样品溶液2.0 mL,置10 mL具塞试管,分别精密加入4%苯酚溶液1.0 mL,摇匀,迅速精密加入浓硫酸7.0 mL,摇匀,沸水保温15 min,取出后迅速用冷水冷却至室温。以纯化水为空白,同法制得空白对照品液。在487 nm波长处测定吸光度,根据标准曲线回归方程计算总多糖含量。结果见表2。

2.6 80%醇浸出物量测定 取各正交实验号浓缩液10 mL,加无水乙醇40 mL,使乙醇浓度达到80%,静置过夜,取上清液于干燥蒸发皿中,水浴蒸干,105℃烘箱干燥3～4 h至恒重,取出,迅速移至干燥器中放冷,取出精密称重即得。结果见表2。

表3 黄芪甲苷加样回收率实验结果 mg,n=5

2.7 方差分析 对正交实验结果作直观分析和方差分析。方差分析见表4。

表4 方差分析表

由直观分析可知,影响提取效果的因素顺序为:煎煮次数＞加水量＞煎煮时间。经方差分析,煎煮时间对提取效果无显著影响,为节约工时,定为B1,煎煮次数和加水量有显著影响,以A3C3为宜。

2.8 验证实验 验证3批。结果见表5。RSD值＜3%,表明所筛选的提取工艺条件基本稳定。

3 讨论

方中黄芪为君药,黄芪甲苷和多糖为黄芪的主要有效成分[14],现代药理研究表明黄芪甲苷具有保护心脏和肝脏、抗细胞凋亡、免疫调节、改善血液流变学等作用[15],黄芪多糖具有增强免疫系统、保肝、降血糖、降血脂、抗氧化延缓衰老等药理活性[16],故将黄芪甲苷含量作为评价工艺优劣的重要指标。方中臣药牛膝,佐药葛根、防风也含有多糖,因此将总多糖含量作为提取工艺的另一个评价指标,80%醇浸出物为大类成分,作为间接控制指标,以此筛选最佳提取工艺具有一定的科学性。

表5 验证实验结果 %,n=3

按正交实验所筛选的最佳提取条件,本实验还比较了石菖蒲、防风二药提油后药渣不再与黄芪、赤芍等药合煎水提和二药提油后药渣与黄芪、赤芍等药合煎水提两种方法主要有效成分的影响。结果表明,分煎后出膏率降低近10%,黄芪甲苷含量无影响,总多糖含量近无影响,为降低出膏率,给后续除杂工艺降低难度,可以考虑将提取路线定为:石菖蒲、防风二药提油后药渣弃去,药液与黄芪、赤芍等药水提液合并。

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DOI 10.3870/yydb.2014.03.032

R286;TQ460.1

A

1004-0781(2014)03-0382-04

2013-07-05

2013-08-22

易生富(1966-),男,湖北荆州人,主任药师,学士,主要研究方向:中药制剂。电话:0716-8023540,E-mail：yishenfu@126.com。