西黄丸乙酸乙酯提取物抗肿瘤活性研究*

马杰，杨伟，关硕，胡俊霞，高文斌，曾常茜，梁文波

(1.遵义医学院，遵义 563000;2.大连大学医学院，大连 116622;3.大连大学附属中山医院肿瘤科，大连116000)

西黄丸乙酸乙酯提取物抗肿瘤活性研究*

马杰1，杨伟2，关硕2，胡俊霞2，高文斌3，曾常茜2，梁文波2

(1.遵义医学院，遵义 563000;2.大连大学医学院，大连 116622;3.大连大学附属中山医院肿瘤科，大连116000)

目的 研究西黄丸乙酸乙酯提取物抗肿瘤作用及对荷瘤大鼠免疫功能的影响,筛查西黄丸的抗肿瘤活性部位。方法用W256乳腺癌细胞建立荷瘤大鼠模型,随机分为正常对照组,模型对照组,阳性药物(香菇多糖)组,西黄丸高剂量组,西黄丸乙酸乙酯提取物高、中、低剂量组。给药治疗14 d,取瘤称重,计算抑瘤率;腹主动脉取血,流式细胞仪检测外周血T淋巴细胞亚群及B7-1的含量;酶联免疫吸附(ELISA)法检测外周血白细胞介素2(IL-2)、IL-6、IL-10、β转化生长因子(TGF-β)、γ干扰素(IFN-γ)表达水平。结果西黄丸乙酸乙酯高剂量组抑瘤率30.41%;西黄丸乙酸乙酯提取物高剂量组、B7-1含量及IL-2、IFN-γ水平均高于模型对照组,IL-6及TGF-β水平均低于模型组;IL-10与阴性对照组比较,均差异无统计学意义(P＞0.05)。结论西黄丸乙酸乙酯提取物通过上调IL-2、IFN-γ水平及提高细胞含量,降低肿瘤相关炎性因子IL-6、TGF-β水平,提高了机体免疫清除功能,发挥抗肿瘤作用,提高原药生物利用度。乙酸乙酯提取物可能是西黄丸的主要活性部位之一。

西黄丸；乙酸乙酯提取物；乳腺癌；肿瘤；细胞因子

西黄丸又称犀黄丸,出自清代王洪绪所著《外科证治全生集·卷四》,由牛黄、麝香、乳香(醋制)、没药(醋制)4味名贵中药组成,是抗肿瘤中成药的经典名方,其主要功效为清热解毒、活血化瘀、软坚散结等[1]。目前广泛用于乳腺癌、肝癌、白血病等恶性肿瘤的治疗及辅助治疗,临床证实其可提高肿瘤患者的生存率,改善中晚期肿瘤患者的生活质量[2]。现代药理研究证实,西黄丸组方药材富含抗癌成分,且主要为脂溶性成分,如牛磺酸、胆红素、麝香酮、β-榄香烯等[3]。笔者通过对西黄丸进行水蒸汽、三氯甲烷、乙酸乙酯和乙醇梯度提取,证实三氯甲烷、乙醇提取的组分均具有良好的抗肿瘤作用[4]。笔者在本实验中观察西黄丸乙酸乙酯提取物对荷瘤大鼠肿瘤生长的抑制作用并探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物与细胞 清洁级Wistar大鼠,雌性,体质量(180±20)g(70只)及(70±10)g(10只),购自大连医科大学实验动物中心,许可证号:SCXK(辽)20080002。大鼠乳腺癌细胞株Walker256,购于中国科学院上海细胞库。

1.2 仪器 流式检测仪FACSVantage为BD公司产品;ELX800型酶标仪为美国BioTek公司产品;PL203型电子精密天平为梅特勒托利多仪器(上海)有限公司产品;飞鸽TDL-40B型台式离心机为上海安亭科学仪器厂产品。

1.3 试剂 荧光标记抗体Anti-Rat CD3 PE;Anti-Rat CD4 FITC;Anti-Rat CD8a PerCP购自于美国Bioscience公司;Anti-Rat CD80 PE购自于美国BioLegend公司;大鼠ELISA试剂盒白细胞介素2(interleukin 2,IL-2)、IL-6、IL-10、转化生长因子β(transforming grouth factor, TGF-β)、干扰素γ(interferon γ,IFN-γ)由上海朗顿生物科技有限公司生产;淋巴细胞分离液为TBD science公司产品;肝素钠注射液(批号:100103)为上海第一生化药业有限公司生产。西黄丸(每20粒质量1 g)由北京同仁堂科技发展股份有限公司制药厂生产(批号:11020073);香菇多糖由浙江普洛康裕天然药物有限公司生产(基片质量0.1 g,批号:120501)。

1.4 西黄丸乙酸乙酯提取物的制备 ①取西黄丸180 g,粉碎,转入500 mL圆底烧瓶,加入3倍体积无水乙酸乙酯,超声振荡30 min,组装热回流提取装置,于电热套上加热回流提取2 h,滤纸过滤,收集滤液;滤渣重复提取2次。合并3次提取液,于37℃恒温水浴锅中挥发乙酸乙酯,得乙酸乙酯提取物收率为7.9%。②采用人与大鼠剂量换算公式,计算各组给药量,西黄丸乙酸乙酯提取物高、中、低分别按108.6,43.5, 21.7 mg·kg-1,西黄丸高剂量按1.37 g·kg-1,阳性对照(香菇多糖)按230 mg·kg-1,以0.5%羧甲基纤维素钠水溶液为溶剂,将给药剂量配制为1 mL·(100 g)-1。空白对照组及模型对照组给予等量溶剂。

1.5 动物模型的建立 ①调整Walker256细胞浓度为2×107个·mL-1,抽取细胞1 mL,注入(70±10)g雌性Wistar鼠腹腔,传代。7～8 d小鼠出现明显腹水症状,收集腹水,磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffered solution,PBS)洗涤,调整细胞浓度为5×107·mL-1。将(180±20)gWistar雌性大鼠,随机取10只不做处理为正常对照;其他按每只0.4 mL肿瘤细胞接种于大鼠右侧腋下建立荷瘤模型,随机分为6组,每组10只[5]。②造模后第2天起,按体质量灌胃给药,每天2次,连续给药14 d。

1.6 大鼠抑瘤率的测定 末次给药前禁食12 h,以20%乌拉坦腹腔麻醉。钝性剥离瘤组织,取瘤称质量,计算肿瘤抑制率。肿瘤抑制率(%)=(模型对照组平均瘤质量-治疗后平均瘤质量)/模型对照组平均瘤质量×100%。

1.7 流式细胞仪检测淋巴细胞亚群及B7-1的含量腹主动脉取血2 mL,适量肝素抗凝,加入等体积PBS液,混匀;缓慢转入2 mL淋巴细胞分离液上层,室温2 000 r·min-1离心20 min;收集淋巴细胞,避光条件下加入相应抗体染色。4℃避光,冰浴20 min,用流式细胞仪检测及黏附分子B7-1含量。

1.8 酶联免疫法检测IL-2、IL-6、IL-10、TGF-β、IFN-γ的表达水平 新鲜血液置于37℃恒温水浴锅静置4 h,3 500 r·min-1室温离心10 min,吸取上层血清,严格按照大鼠IL-2、IL-6、IL-10、TGF-β、IFN-γ定量酶联检测试剂盒说明书操作。在酶标仪波长450 nm处测吸光度(A)值,通过标准曲线获取血清中IL-6、IL-10、TGF-β浓度。

2 结果

2.1 西黄丸乙酸乙酯提取物对荷瘤大鼠肿瘤生长的影响 接种Walker256后,大鼠精神状态较差,进食减少,行动呆滞,皮毛粗糙无光泽;4～5 d均有瘤块实体直径约0.5 cm。而阳性对照及西黄丸乙酸乙酯提取物给药组大鼠食量及运动状态均好于模型对照组。西黄丸乙酸乙酯提取物具有一定的抑瘤作用,其高剂量组抑瘤率30.41%,与模型对照组比较,瘤质量显著降低(P＜0.05);与西黄丸高剂量组(33.13%)比较,差异无统计学意义,结果见表1。

2.2 西黄丸乙酸乙酯提取物对荷瘤大鼠外周血淋巴细胞亚群及B7-1含量的影响 与正常对照组比较,模型对照组血清含量显著降低(P＜ 0.05);西黄丸乙酸乙酯提取物中剂量组综合指标优于西黄丸高剂量组,差异无统计学意义;与模型对照组比较,西黄丸乙酸乙酯提取物高剂量组1含量显著升高(P＜0.01),结果见表2。

2.3 西黄丸乙酸乙酯提取物对荷瘤大鼠外周血细胞因子的影响 与正常对照组比较,模型对照组血清IL-2、IFN-γ水平显著降低,IL-6、IL-10、TGF-β水平显著升高(P＜0.01);与模型对照组比较,西黄丸乙酸乙酯提取物高剂量组血清IL-2、IFN-γ水平显著升高(P＜0.01),IL-6、TGF-β显著降低(P＜0.05),结果见表3,4。

表1 7组大鼠肿瘤生长的情况Tab.1 The tumor growth of seven groups of rats ±s

表1 7组大鼠肿瘤生长的情况Tab.1 The tumor growth of seven groups of rats ±s

与模型对照组比较,*1P＜0.05Compared with model control group,*1P＜0.05

组别剂量/(mg·kg-1)大鼠/只瘤质量/g抑瘤率/%正常对照组0.0100.00±0.000.00模型对照组0.0106.61±0.610.00西黄丸乙酸乙酯提取物高剂量组108.6104.60±0.42*130.41中剂量组43.5105.13±0.3722.39低剂量组21.7105.71±0.5013.62西黄丸高剂量组1 370104.42±0.57*133.13香菇多糖组230105.00±0.44*124.36

3 讨论

西黄丸由牛黄、麝香、乳香、没药粉碎,辅以黏米饭制成,其活性组分在治疗中主要依赖溶出,生物利用度不高。笔者采用水蒸汽、三氯甲烷、乙酸乙酯和乙醇进行梯度提取,以筛选西黄丸抗肿瘤的活性部位,提高其生物利用度。研究结果显示,西黄丸乙酸乙酯提取物具有明确的抑瘤作用,与模型对照组比较,高剂量组瘤质量明显降低,但其抗肿瘤活性与西黄丸高剂量组类似,提示西黄丸乙酸乙酯提取物是西黄丸抗肿瘤作用主要活性部位之一。

肿瘤的发生、发展不仅取决于肿瘤细胞本身,还取决于肿瘤细胞生存的环境[6]。免疫系统具有免疫清除功能,因而消灭和杀伤肿瘤细胞;但同时也会对肿瘤细胞产生“筛选”作用,这可能促进肿瘤向恶性程度的分化,而肿瘤细胞也会对机体的免疫系统产生重塑作用,改变机体的免疫环境。随着对肿瘤免疫机制的深入研究,免疫编辑理论的提出深刻地阐释了机体免疫系统与肿瘤的相互作用,即免疫清除、免疫平衡、免疫逃逸[7]。在免疫清除过程中,IL-2、IFN-γ可促进CD+3、CD+4的含量,提高肿瘤细胞的抗原提呈能力,促进机体对肿瘤细胞的识别能力;同时诱导CD+8的产生对肿瘤细胞产生靶向杀伤作用[8]。黏附分子B7是T细胞活化、增殖的重要共刺激信号,可促进T细胞的活化增殖。本研究发现,西黄丸乙酸乙酯提取物高剂量可显著提高IL-2、IFN-γ的水平及CD+3、CD+8、B7-1的含量,说明西黄丸乙酸乙酯提取物可提高荷瘤机体的免疫清除功能。

研究表明,IL-6、IL-10、TGF-β是形成肿瘤免疫抑制微环境的重要因子,具有抑制免疫和促进肿瘤生长的作用。肿瘤组织通过高分泌IL-6,诱导机体免疫耐受促进肿瘤生长,且多种恶性肿瘤与IL-6表达呈正相关[9]。IL-10可以通过抑制抗原提呈细胞的提呈作用[10]。TGF-β可以抑制机体的多重抗肿瘤效应,抑制淋巴细胞产生IL-2,促进血管生成等[11]。本研究发现高剂量西黄丸乙酸乙酯提取物可显著降低IL-6、TGF-β的水平,发挥提高肿瘤细胞免疫原性,激活淋巴细胞产生抗肿瘤作用,进一步增强免疫清除功能,提示西黄丸乙酸乙酯提取物可能具有逆转免疫逃逸的作用。有关西黄丸抗肿瘤物质基础及其逆转免疫抑制状态的分子作用机制尚需进一步研究。

表2 7组大鼠外周血淋巴细胞亚群及B7-1的检测值Tab.2 The detection results of peripheral blood lymphocyte subset and B7-1 in seven groups of rats ±s,%,n=10

表2 7组大鼠外周血淋巴细胞亚群及B7-1的检测值Tab.2 The detection results of peripheral blood lymphocyte subset and B7-1 in seven groups of rats ±s,%,n=10

与模型对照组比较,*1P＜0.05,*2P＜0.01Compared with model control group,*1P＜0.05,*2P＜0.01

组别大鼠/只剂量/(mg·kg-1)CD+3CD+4CD+8B7-1(CD80)正常对照组100.080.95±5.25*149.94±4.29*131.02±4.06*142.07±6.96*1模型对照组100.041.25±2.9119.09±3.1422.13±2.0814.49±5.19西黄丸乙酸乙酯提取物高剂量组10108.657.37±3.25*227.99±2.5629.38±2.73*228.26±3.05*2中剂量组1043.555.06±3.7424.14±4.0030.92±4.03*124.39±3.29*2低剂量组1021.746.61±4.3621.94±3.8724.67±3.6416.63±4.24西黄丸高剂量组101 37058.98±5.56*231.99±3.1026.99±5.7025.83±2.12*2香菇多糖组1023058.84±4.51*230.69±2.0328.15±3.73*221.93±5.07*2

表3 7组大鼠外周血IL-2、IL-6、IL-10的检测值Tab.3 The detection results of IL-2,IL-6 and IL-10 in peripheral blood in seven groups of rats ng·L-1,±s

表3 7组大鼠外周血IL-2、IL-6、IL-10的检测值Tab.3 The detection results of IL-2,IL-6 and IL-10 in peripheral blood in seven groups of rats ng·L-1,±s

与模型对照组比较,*1P＜0.01,*2P＜0.05Compared with model control group,*1P＜0.01,*2P＜0.05

组别大鼠/只剂量/(mg·kg-1)IL-2IL-6IL-10正常对照组100.0218.33±15.87*141.79±7.39*148.68±3.43*1模型对照组100.0147.86±12.07103.96±8.5793.19±2.45西黄丸乙酸乙酯提取物高剂量组10108.6195.45±11.24*260.42±6.18*285.34±3.76中剂量组1043.5183.39±10.93*283.30±7.8384.73±4.48低剂量组1021.7162.02±12.7685.69±9.0287.46±3.59西黄丸高剂量组101 370190.62±10.90*272.60±7.63*270.30±5.08*2香菇多糖组10230187.80±8.09*277.81±7.21*285.24±2.04

表4 7组大鼠外周血TGF-β、IFN-γ的检测值Tab.4 The detection results of TGF-β and IFN-γ in peripheral blood in seven groups of rats ng·L-1,±s,n=10

表4 7组大鼠外周血TGF-β、IFN-γ的检测值Tab.4 The detection results of TGF-β and IFN-γ in peripheral blood in seven groups of rats ng·L-1,±s,n=10

与模型对照组比较,*1P＜0.01,*2P＜0.05Compared with model control group,*1P＜0.01,*2P＜0.05

组别剂量/(mg·kg-1)TGF-βIFN-γ正常对照组0.0139.02±12.61*1267.42±11.65*1模型对照组0.0221.22±13.75195.08±6.95西黄丸乙酸乙酯提取物高剂量组108.6162.35±10.17*2251.28±7.33*1中剂量组43.5185.46±8.89225.55±9.58低剂量组21.7206.08±9.26203.83±6.79西黄丸高剂量组1 370170.48±6.51*2246.80±10.38*2香菇多糖组230183.57±7.46243.38±8.61*2

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DOI 10.3870/yydb.2014.03.008

Antitumor Effects of Ethyl Acetate Extract from Xihuang Pills

MA Jie1,YANG Wei2,GUAN Shuo2,HU Jun-xia2,GAO Wen-bin3,ZENG Chang-qian2,LIANG Wen-bo2
(1.Zunyi Medical College,Zunyi 563000,China;2.Medical College of Dalian University,Dalian 116622, China;3.Department of Oncology,Affiliated Zhongshan Hospital of Dalian University,Dalian,116000,China)

Objective This research aimed to study the antitumor activity and immunologic function of ethyl acetate extracts fromχihuangpills on tumor-bearing rats.MethodsThe Walker256 bearing rats were randomly divided into 7 groups (n=10):normal control,model control,different doses of ethyl acetate extracts fromχihuangpills,and lentinan plus high dose ofχihuangpill groups.After the drug administration for a consecutive 14 days,the inhibitory rate of tumor was measured.FCM method was used in determination of serum levels ofB7-1.ELISA method was applied in measuring serum levels of IL-2,IL-6,IL-10,TGF-β and IFN-γ.ResultsThe ethyl acetate extract fromχihuangpills effectively inhibited the growth of Walker256 by 30.41%.Compared with the model control,serum levels of IL-2,IFN-γ andB7-1 were significantly higher(P＜0.05),and those of IL-6 and TGF-β were significantly lower(P＜0.05)in the high doseχihuangpill ethyl acetate extracs group.No significant difference in the level ofand IL-10 was found in the control.ConclusionThe ethyl acetate extracts fromχihuangpills is one of the active constituent parts for inhibition of tumor growth by elevating IL-2,IFN-γ and,B7-1 and reducing IL-6 and TGF-β.

Xihuangpill;Ethyl acetate extract;Mammary cancer;Tumor;Cytokine

R286;R965

A

1004-0781(2014)03-0303-04

2013-06-20

2013-07-22

*大连金州新区科技计划(2012-A1-046)

马杰(1988-),男,湖北十堰人,硕士,主要从事中药抗肿瘤药理研究。电话:0411-87403952,E-mail：429671086@qq.com。

梁文波,男,教授,研究方向:中药抗肿瘤药理。电话:0411-87403409,E-mail：dllwb@126.com。