紫杉醇自微乳释药体系的处方工艺及稳定性研究*

周丽娟,陈曦,刘清飞,王义明,罗国安

(1.郑州大学附属郑州中心医院转化医学中心实验室,郑州 450007;2.清华大学生命科学与医学研究院,北京 100084)

·药物制剂与药品质量控制·

紫杉醇自微乳释药体系的处方工艺及稳定性研究*

周丽娟1,2,陈曦2,刘清飞2,王义明2,罗国安2

(1.郑州大学附属郑州中心医院转化医学中心实验室,郑州 450007;2.清华大学生命科学与医学研究院,北京 100084)

目的 优选紫杉醇自微乳的处方工艺,并研究其稳定性。方法以性状、粒径、含量、有关物质、细菌内毒素等为测定指标,考查不同pH和不同活性炭用量对工艺的影响,筛选出优化处方,并对其进行稳定性研究。结果制备的紫杉醇自微乳为淡黄色澄明液体,平均粒径19.6 nm,呈Gauss分布。紫杉醇自微乳释药体系(PTX-SMEDDS)经高速离心后稳定,影响因素实验结果表明,PTX-SMEDDS对高温和光不稳定。6个月的加速实验表明,各项指标均无明显变化。确定紫杉醇自微乳应密封、低温避光保存。结论紫杉醇自微乳制备工艺简便,制剂稳定,载药量高,适宜开发为注射自微乳释药体系。

紫杉醇;自微乳释药体系;制备;稳定性

紫杉醇(paclitaxel,PTX)是一种新型的微管稳定剂,临床上用于卵巢癌和乳腺癌及非小细胞肺癌的一线和二线治疗[1]。紫杉醇由于水溶性极差(约0.001 g·L-1),且口服药物不吸收,已上市的紫杉醇注射液是以50%聚氧乙烯蓖麻油作为增溶剂,临床应用中伴有严重的变态反应、血液毒性、神经毒性和低血压,还可导致PVC包装中增塑剂的溶出,毒性增加,且制剂稀释后易析出结晶,在临床应用受到了限制[2]。自微乳释药系统(self-microemulsifying drug delivery system,SMEDDS)是在微乳研究的基础上发展起来的,由药物、油相(oil)、表面活性剂(surfactant,SA)和助表面活性剂(cosurfactant,CoSA)组成的热力学稳定、均一、透明的溶液。可作为疏水性、难吸收、易水解药物的载体,具有能够提高难溶性药物的溶解度,提高生物利用度,减少注射引起的疼痛等特点,是难溶性药物的理想注射用载体[3-4]。笔者在本研究中制备了紫杉醇自微乳释药体系(paclitaxel self-microemulsifying drug delivery system,PTX-SMEDDS),进行了处方工艺的研究,并对其稳定性进行评价。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Agilent 1100型高效液相色谱仪(美国Agilent公司);激光粒度散射仪(Nano ZS90型,英国Malvern公司);冷冻蚀刻仪(BALZERS BAF-400D型,列支敦士登公国Balzers公司);电子分析天平(XS105型,瑞士梅特勒-托利多公司);涡旋混合器(VDRTEX-5型,江苏海门其林贝尔仪器公司);磁力搅拌器(EMS-8A型,天津市欧诺仪表公司);恒温恒湿箱(SPX-250,上海特讯实业有限公司医疗设备厂)。

1.2 试药 PTX原料(重庆美联药业有限公司,批号:091211,纯度:99.53%);PTX-SMEDDS(自制,批号110806,110808,110810,规格:5 mL∶30 mg);PTX对照品(批号:101310-200906)、炔诺酮对照品(norethindrone,NTD,批号:100053-200705)均为中国食品药品检定研究院提供;聚氧乙烯蓖麻油(polyoxyethylenated castor oil,EL35,德国BASF公司);卵磷脂(S-100)、中碳链甘油酯(medium chain triglycerid,MCT)均为德国Lipoid公司产品;维生素E (VitE,广州白云山制药总厂);脱氧胆酸钠(DOC-Na,美国Sigma公司);甲醇、乙腈(色谱纯,德国Merck公司);其余试剂均为分析纯,水为注射用水。

2 方法与结果

2.1 PTX-SMEDDS含量测定 参照《新药转正质量标准》第25册中紫杉醇注射液的质量标准含量测定方法进行实验。

2.1.1 色谱条件 GraceSmart RP C18(250 mm× 4.6 mm,5 μm)色谱柱;流动相:甲醇-乙腈-水(30∶30∶40);流速:1.0 mL·min-1;检测波长:227 nm;柱温:30℃;进样量10 μL。

2.1.2 方法学实验 PTX空白自微乳不干扰PTX的测定(图1);在该实验条件下,PTX的最低检出量为0.6 ng(S/N≥3),PTX与NTD的保留时间分别为9.015,7.783 min,理论板数分别为17 576,13 259,分离度为4.93。标准曲线方程为F=0.060 1C+0.010 4 (r=0.999 9,n=7)。测定日内8 h和日间3 d的精密度,RSD分别为0.36%(n=6)和0.58%(n=6);平均回收率99.61%,RSD=0.82%(n=9)。结果说明该方法测定PTX-SMEDDS中PTX的含量可行。

2.2 有关物质测定 参照紫杉醇注射液的质量标准。采用HPLC法检查本品的有关物质。

2.2.1 色谱条件 Agilent1100色谱仪(DAD检测器),Agilent TC18(250 mm×4.6 mm,5 μm),检测波长227 nm,流速1.5 mL·min-1,以乙腈-水为流动相进行梯度洗脱。初始流动相为乙腈-水(40∶60),洗脱至主峰出完(约35 min),然后以每分钟1.6%的速度增加乙腈的比例,25 min后,乙腈比例增至80%,再以每分钟4%的速度降低乙腈的比例,10 min后,乙腈比例降至40%,保持此比例10 min。

2.2.2 方法学实验 PTX空白自微乳不干扰测定;理论板数N按PTX峰计算为15 044,PTX和前后杂质峰的分离度分别为19.34和10.59(图2)。对PTXSMEDDS进行酸破坏实验、碱破坏实验、高温破坏实验、氧化破坏实验、光破坏实验后溶液,分别调节成中性后,加流动相制成测定液,依法进样测定,结果杂质峰和PTX能良好分离。

2.3 粒径测定 参照《中华人民共和国药典》2010年版二部附录ⅪⅩE的要求,采用激光粒度散射仪测定[5]。

2.4 无菌检查 取本品,各取1 mL,分别加灭菌水制成每毫升中含1 mg的溶液,依法检查(《中华人民共和国药典》2010年版二部附录ⅪH),应符合规定。

2.5 细菌内毒素检查 取本品,以细菌内毒素检查用水稀释40倍后,依法检查(《中华人民共和国药典》2010年版二部附录ⅥE),本品每毫升含细菌内毒素应小于2.4 EU。

A.空白自微乳;B.PTX对照品;C.PTX-SMEDDS;1.NTD;2.PTX图1 PTX的HPLC图A.blank SMEDDS;B.PTX reference substance;C.PTX-SMEDDS;1.NTD;2.PTXFig.1 HPLC chromatograms of PTX

A.PTX-SMEDDS 4.8 mg·L-1;B.PTX-SMEDDS 480 mg·L-1;1.PTX图2 PTX有关物质测定的HPLC图A.4.8 mg·L-1PTX-SMEDDS;B.480 mg·L-1PTX-SMEDDS;1.PTXFig.2 HPLC chromatograms for related substances of PTX

2.6 PTX-SMEDDS的制备和质量考察

2.6.1 PTX-SMEDDS的处方 PTX 60 mg,EL35 32%,S-100 8%,Doc-Na 0.6%,无水乙醇48%,MCT 7.5%,VitE0.5%。

2.6.2 PTX-SMEDDS的制备工艺 氮气流下,取处方量的S-100和无水乙醇置适当容器中,搅拌使S-100溶解,加入EL35、VitE、MCT、Doc-Na混匀后,加入处方量的PTX,搅拌使溶解。加入适量的无水柠檬酸,调节pH至4.0,加入0.25%注射用活性炭,35℃保温30 min,经孔径0.22 μm微孔滤膜过滤脱炭,无菌灌封入安瓿瓶中,即得。按制备工艺制备3批PTXSMEDDS,批号为110806,110808,110810。

2.6.3 活性炭用量的选择 氮气流下,按“2.6.2”项下的配制方法,加入适量的无水柠檬酸,调节pH至4.0,分成5份,分别加入0%,0.05%,0.15%,0.25%, 0.40%(W/V)的活性炭,35℃保温30 min,过滤脱炭后,无菌分装即得。分别考察在不同活性炭用量下性状、含量、有关物质、热原的变化。结果在不同的活性炭用量的条件下,PTX-SMEDDS均呈淡黄色透明液体。只有加入0.40%活性炭用量,与脱炭前相比,含量有所下降,其余含量均变化不大。有关物质均无明显变化。当活性炭的用量达到0.15%以上时,细菌内毒素才符合规定。因PTX对高温不稳定,综合以上因素考虑:定脱炭工艺为0.25%活性炭、35℃保温30 min即可。

2.6.4 pH的选择 氮气流下,按“2.6.2”项下的配制方法,分成5份,加入无水柠檬酸,分别调节pH为3.0, 3.5,4.0,4.5,5.0,各加入0.25%注射用活性炭,35℃保温30 min,过滤脱炭后,无菌封装即得。分别考察在不同pH下性状、含量、有关物质、0.9%氯化钠注射液和5%葡萄糖注射液稀释10倍后粒径的变化。结果在不同的pH条件下,PTX-SMEDDS均呈淡黄色澄明液体。在可允许使用的pH范围内,粒径、有关物质、含量均未发生较大变化。说明pH在3～5的范围内对微乳无影响。结合PTX注射液质量标准中规定的pH和PTX在酸性条件下较稳定[6],将PTX-SMEDDS的pH定为3.0～5.0。

2.6.5 稳定性实验

2.6.5.1 离心稳定性 将PTX-SMEDDS用0.9%的氯化钠注射液和5%的葡萄糖注射液分别稀释10倍和20倍后,轻摇形成微乳,观察沉淀和分层,并将稀释后的微乳置于具塞试管中,3 000 r·min-1离心30 min[7]。结果稀释形成微乳后12 h内未见有沉淀产生和分层现象,且经30 min离心实验,微乳仍为澄明且略带乳光的淡黄色溶液,不分层。该自微乳形成微乳的稳定性良好。

2.6.5.2 配伍实验 将批号为110806的PTX-SMEDDS用0.9%的氯化钠注射液和5%的葡萄糖注射液分别稀释10倍和50倍后,结果配伍12 h内微乳澄清透明,无沉淀析出。将放置12 h的稀释液用微孔滤膜过滤后,测定pH、粒径、含量[8]。结果与配伍0 h相比,各项指标均无明显变化。说明PTX-SMEDDS与0.9%的氯化钠注射液和5%的葡萄糖注射液配伍12 h稳定性良好。

2.6.5.3 影响因素实验 取PTX-SMEDDS(110806),置于60,40,4℃、光照(4 000～5 000 Lx)条件下放置10 d,分别于0,5,10 d末取样测定及冻融实验(将样品置于-4℃2 d,再放置于40℃2 d,即冻融1次,连续循环3次),取样考察外观、pH、含量、粒径、有关物质[8]。结果:PTX-SMEDDS经强光照射后,溶液颜色变浅;60℃实验条件下有关物质从0.43%增加到1.40%,其他条件各项指标均无明显变化。表明PTXSMEDDS受温度影响较大,高温贮藏不稳定,应低温避光放置。结果见表1。

2.6.5.4 加速实验 取PTX-SMEDDS(批号:110806, 110808,110810)于(40±2)℃恒温箱中放置6个月进行加速实验,分别于0,1,2,3,6个月时取样考察外观、pH、含量、粒径、有关物质等,各项指标与0 d时数据比较,外观均为淡黄色澄明液体,各项指标均无明显变化。见表2。于6个月末进行细菌内毒素和无菌检查,结果符合规定。

3 讨论

本品的含量测定方法参照PTX注射液质量标准中的色谱条件进行了流动相比例的调节,经方法学实验确定流动相为甲醇-乙腈-水(30∶30∶40),节省分析时间,回收率高,精密度和重现性好。且PTXSMEDDS采用甲醇稀释制成测定液,操作简便,便于样品的分析。

PTX在水中的溶解度约0.001 g·L-1,将其制成PTX-SMEDDS后,载药量可达到为6 g·L-1,是目前PTX的有关文献报道[9-10]中载药量最大的自微乳,且经有关实验表明,PTX-SMEDDS经氯化钠注射液和葡萄糖注射液稀释后的相比市售PTX注射液更不易导致PTX的析出。

表1 PTX-SMEDDS影响因素实验结果Tab.1 Results of stress testing on PTX-SMEDDS ±s,n=3

表1 PTX-SMEDDS影响因素实验结果Tab.1 Results of stress testing on PTX-SMEDDS ±s,n=3

实验条件时间/dpH含量/(g·L-1)粒径/nm有关物质/% 40℃03.91±0.026.07±0.0119.6±0.30.43±0.01 5 3.88±0.016.06±0.0019.1±0.40.45±0.02 103.87±0.016.08±0.0118.9±0.30.44±0.02 60℃53.90±0.026.06±0.0119.3±0.40.71±0.03 103.91±0.016.05±0.0020.1±0.21.40±0.02 4℃53.91±0.016.09±0.0119.9±0.40.40±0.01 103.90±0.026.07±0.0019.3±0.30.44±0.02光照53.90±0.016.08±0.0118.6±0.20.47±0.03 103.89±0.026.07±0.0120.3±0.40.42±0.02冻融实验1次3.89±0.016.08±0.0019.5±0.10.48±0.01 2次3.90±0.016.07±0.0119.6±0.20.45±0.03 3次3.92±0.026.09±0.0119.2±0.30.46±0.02

表2 PTX-SMEDDS加速实验结果Tab.2 Results of accelerated test on PTX-SMEDDS ±s,n=3

表2 PTX-SMEDDS加速实验结果Tab.2 Results of accelerated test on PTX-SMEDDS ±s,n=3

批号时间/个月pH含量/(g·L-1)粒径/nm有关物质/% 11080603.91±0.026.07±0.0119.6±0.30.43±0.01 1 3.93±0.016.04±0.0119.8±0.40.42±0.02 2 3.89±0.026.06±0.0119.0±0.30.44±0.03 3 3.87±0.016.09±0.0218.6±0.30.46±0.02 6 3.90±0.026.05±0.0118.5±0.40.47±0.01 11080804.10±0.015.98±0.0120.1±0.40.49±0.01 1 4.06±0.016.01±0.0018.9±0.30.46±0.02 2 4.08±0.026.02±0.0119.3±0.40.50±0.02 3 4.05±0.015.99±0.0019.7±0.30.46±0.03 6 4.06±0.015.97±0.0119.4±0.10.48±0.01 11081004.23±0.016.16±0.0019.3±0.30.43±0.03 1 4.20±0.026.17±0.0118.2±0.30.47±0.01 2 4.25±0.016.15±0.0118.9±0.20.46±0.02 3 4.19±0.016.13±0.0018.7±0.10.43±0.01 6 4.22±0.016.15±0.0119.6±0.40.44±0.03

PTX-SMEDDS经长期实验放置后,十分稳定,性状、pH、含量、有关物质等均无明显变化。本研究中EL35用量比市售PTX注射液减少了36%。预实验考察了PTX-SMEDDS在体外的溶血性、豚鼠急性过敏性和小鼠尾静脉注射急性毒性,结果发现PTX-SMEDDS体外溶血性、变态反应的发生率和死亡率均低于市售注射液。PTX-SMEDDS小鼠尾静脉注射的LD50为市售注射液的1.9倍,毒性降低。下一步实验中安全性评价将会做深入的研究。但PTX-SMEDDS被注射进入体内,经血浆及体内环境无限稀释后是否稳定,在体内能否起到肿瘤靶向作用,需进一步深入研究。

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DOI 10.3870/yydb.2014.08.023

Formulation and Stability Studies on Paclitaxel Self-microemulsifying Drug Delivery System

ZHOU Li-juan1,2,CHEN Xi2,LIU Qing-fei2,WANG Yi-ming2,LUO Guo-an2(1.Central Laboratory of Translational Medicine,Affiliated Zhengzhou Central Hospital of Zhengzhou University,Zhengzhou 450007, China;2.Institute of Biomedicine,Tsinghua University,Beijing 100084,China)

Objective To study the preparation and stability of paclitaxel self-microemulsifying drug delivery system (PTX-SMEDDS).MethodsThe formulation of the PTX-SMEDDS was optimized by monitoring the appearance,particle size, concentration,relative substance,and bacterial endotoxin.Influence of different pH and different dosage of activated carbon on PTX-SMEDDS was investigated.Subsequently it was subjected to stability studies.ResultsThe PTX-SMEDDS was a translucent diluted-yellow solution with a mean diameter of 19.6 nm.High speed centrifugal test indicated PTX-SMEDDS was stable.The result of the influential factor tests showed PTX-SMEDDS was unstable to high temperature and light.In the accelerated tests for 6 months,the quality of PTX-SMEDDS was stable.The samples should be sealed and stored at low temperature and shady place.ConclusionEasily prepared and stable formulation of PTX-SMEDDS is achieved,and further investigation is warranted to develop self-microemulsifying drug delivery system for injection.

Paclitaxel;Self-microemulsifying drug delivery system;Preparation;Stability

R979.1;TQ460.6

A

1004-0781(2014)08-1063-05

2013-10-09

2014-01-29

*国家自然科学基金资助项目(30500666);清华大学-裕元基金资助项目(20240000548)

周丽娟(1979-),女,河南郑州人,主管药师,硕士,从事药物新技术研究。电话:0371-67690264,E-mail: zhou750423@126.com。

罗国安(1946-),男,北京人,教授,博士生导师,从事中药方剂化学和现代中药质量控制体系、新型给药系统研究。电话:010-62781688,E-mail:luoga@chem.tsinghua. edu.cn。